304 kowiri tira ngongo ngongo wae matū , Kei roto i te hanganga o te SPACA6 ectodomain he whaanau nui o nga pūmua e pa ana ki te whakakotahitanga gamete.

Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Kei te whakamahi koe i tetahi putanga tirotiro me te tautoko CSS iti.Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tua atu, hei whakarite i te tautoko tonu, ka whakaatuhia e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Rēreti e whakaatu ana i nga tuhinga e toru mo ia kiriata.Whakamahia te patene o muri me te taha o muri hei nuku i roto i nga kiriata, ko nga paatene mana kiriata kei te pito ki te neke ma ia kiriata.

Ko te SPACA6 he pūmua mata kua whakahuahia i roto i te parāoa he mea tino nui mo te whakakotahitanga o te gamete i te wa e whakawhanaunga ai te wahine whakangote.Ahakoa tenei mahi nui, ko te mahi motuhake a SPACA6 kaore i te tino marama.Ka whakamaramahia e matou te hanganga karaihe o te rohe extracellular o SPACA6 i te taumira o te 2.2 Å, e whakaatu ana i te pūmua e rua-rohe i tito mai i te paihere wha-whaa me nga β-sandwiches rite Ig i honoa e nga hononga kua rite.He rite te hanga nei ki te IZUMO1, tetahi atu pūmua hono-hononga-gamete, na te SPACA6 me te IZUMO1 i whakatu hei mema o te whanau nui o nga pūmua whai-kikiritanga e kiia nei ko te IST superfamily.Ko te whanau nui o te IST he mea hangai e tana paihere wha-helix miro me te rua o nga kaupapa CXXC hono-disulfide.Ko te rapunga a AlphaFold i runga i te hanganga o te poroteome tangata i kitea etahi atu mema pūmua o tenei whanau nui;otira, ko te nuinga o enei pūmua ka uru ki te whakakotahitanga gamete.Ko te hanganga SPACA6 me tona hononga ki etahi atu mema o te IST superfamily e whakarato ana i te hononga ngaro i roto i to maatau mohiotanga mo te whakakotahitanga gamete mammalian.
Ko nga oranga tangata katoa ka timata ki te rua kemu haploid motuhake: ko te parāoa o te papa me te hua manu a te whaea.Ko tenei parāoa te toa o te tukanga whiriwhiri kaha i roto i nga miriona o nga pūtau parāoa e haere ana i roto i te waahanga taihemahema wahine, ka hinga i nga momo aukati1 me te whai i te kaha, e whakarei ake ai i te motini me te tukanga o nga waahanga mata2,3,4.Ahakoa ka kitea e te sperm me te oocyte tetahi ki tetahi, kaore ano kia mutu te mahi.Ko te oocyte e karapotia ana e te paparanga o nga pūtau cumulus me te arai glycoprotein e kiia nei ko te zona pellucida, me uru atu te parāoa ki te uru ki roto i te oocyte.Ka whakamahia e te Spermatozoa te huinga o nga ngota ngota piri o te mata me nga ngota e pa ana ki te kiriuhi me te huna ki te hinga i enei aukati whakamutunga5.Ko te nuinga o enei ngota ngota me nga enzyme e rongoa ana i roto i te kirikiri o roto me te matrix acrosomal ka kitea i te wa e lysed te kiriuhi o waho o te parāoa i te tauhohenga acrosomal6.Ko te mahi whakamutunga i roto i tenei haerenga kaha ko te whakakotahitanga sperm-egg fusion, e hono ai nga ruma e rua i o raua kiriuhi kia noho hei rauropi diploid kotahi7.Ahakoa ko tenei tukanga he pakaruhanga whenua i roto i te whakaputa uri tangata, kaore i te tino maramatia nga taunekeneke irapoi e tika ana.
I tua atu i te whakakikiritanga o nga kemu, kua tino rangahauhia te matū o te whakakotahitanga o nga rua lipid e rua.I te nuinga o te waa, ko te whakakorikori kiriuhi he tukanga tino kino e hiahia ana te whakakorikori pūmua ki te whakarereke i te hanganga o te hanganga e piri tahi ai nga kiriuhi e rua, ka pakaru te haere tonu me te whakakotahitanga8,9.E mohiotia ana enei whakakōkī pūmua he fusogens, ā, kua kitea i roto i te maha o ngā pūnaha hanumi.E hiahiatia ana mo te urunga huaketo ki roto i nga pūtau kaihautu (hei tauira, gp160 i roto i te HIV-1, te pupuhi i roto i nga coronaviruses, hemagglutinin i roto i nga huaketo rewharewha)10,11,12 placental (syncytin)13,14,15 me te whakakotahitanga hanga kemu i roto i nga eukaryotes raro ( HAP2/GCS1 i roto i nga tipu, i nga protist me nga angawaho) 16,17,18,19.Ko nga fusogens mo nga keemu tangata kaore ano kia kitea, ahakoa he maha nga pūmua kua kitea he mea tino nui mo te taapiri keemu me te whakakotahitanga.Ko te CD9 kua whakahuahia te oocyte, he pūmua transmembrane e hiahiatia ana mo te whakakotahitanga o te kiore me te keemu tangata, ko te tuatahi i kitea 21,22,23.Ahakoa kei te noho marama tonu tana mahi, he waahi ki te piri, te hanganga o te atanga piri ki runga i te microvilli hua manu, me te tika o te whakatakotoranga o nga pūmua mata oocyte te ahua 24,25,26.Ko nga pūmua tino angamaheni e rua e tino nui ana mo te whakakotahitanga gamete ko te pūmua parāoa IZUMO127 me te pūmua oocyte JUNO28, a ko to raua hononga tetahi he taahiraa nui i roto i te mohiotanga kemu me te piri i mua i te whakakotahitanga.Ko nga kiore Izumo1 knockout tane me nga kiore Juno knockout wahine he tino horomata, i enei tauira ka uru te parāoa ki te waahi perivitelline engari kaore nga kemu e hono.Waihoki, i whakaitihia te whakakotahitanga i te wa i rongoahia ai nga gametes ki te anti-IZUMO1 me te JUNO27,29 antibody i roto i nga whakamatautau whakangao tangata in vitro.
I tata nei, kua kitea he roopu hou o nga pūmua kua whakahuahia te parāoa e rite ana ki te IZUMO1 me te JUNO20,30,31,32,33,34,35.Ko te sperm acrosomal membrane-associated protein 6 (SPACA6) kua kitea he mea tino nui mo te kikiritanga i roto i te rangahau mutagenesis murine nui.Ko te whakauru o te transgene ki roto i te ira Spaca6 ka whakaputa i te spermatozoa kore e taea te whakauru, ahakoa ka kuhu enei spermatozoa i te waahi perivitelline 36 .Ko nga rangahau knockout i muri mai i nga kiore i whakapumautia e hiahiatia ana a Spaca6 mo te gamete fusion 30,32.Ko te SPACA6 e whakaatu tata ana i roto i nga whakamatautau me te ahua o te waahi e rite ana ki te IZUMO1, ara i roto i te intima o te spermatozoa i mua i te tauhohenga acrosomal, ka heke ki te rohe equatorial i muri i te tauhohenga acrosomal 30,32.Kei roto nga momo homologues Spaca6 i roto i nga momo whakangote me etahi atu eukaryotes 30 me tona hiranga mo te whakakotahitanga gamete tangata kua kitea ma te aukati i te whakakikiritanga tangata i roto i te vitro ma te aukati ki te SPACA6 30.Kaore i rite ki a IZUMO1 me JUNO, ko nga korero mo te hanganga, nga taunekeneke, me te mahi a SPACA6 kei te noho marama.
Kia pai ake ai te mohio ki te tukanga taketake e whai ana i te hanumi o te parāoa tangata me nga hua manu, e taea ai e matou te whakamohio i nga whanaketanga a meake nei mo te whakamahere whanau me te maimoatanga hua, i whakahaerehia e matou nga rangahau hanganga me te matū koiora SPACA6.Ko te hanganga karaihe o te rohe extracellular o SPACA6 e whakaatu ana i te paihere wha-helical (4HB) me te rohe immunoglobulin-rite (Ig-like) e honoa ana e nga rohe ahua-ngawari.Ka rite ki te tohu i roto i nga rangahau o mua, ko te 7,32,37 te hanganga rohe o SPACA6 he rite ki te IZUMO1 tangata, a ko nga pūmua e rua e wehewehe ana i te kaupapa rereke: 4HB me te mata helical tapatoru me te rua o nga kaupapa CXXC hono-disulfide.Ko ta matou whakaaro ko IZUMO1 me te SPACA6 inaianei ka tautuhi i tetahi whanau nui ake, he hanga hangahanga o nga pūmua e hono ana ki te hanumi gamete.Ma te whakamahi i nga ahuatanga ahurei ki te whanau nui, i whakahaerea e matou he rapunga mo te AlphaFold proteome hangahanga tangata, te tautuhi i etahi atu mema o tenei whanau nui, tae atu ki etahi mema e uru ana ki te whakakotahitanga gamete me te whakakikiritanga.Inaianei kua kitea he kopa hanga noa me te whanau nui o nga pūmua e hono ana ki te whakakotahitanga kemu, a ko ta matou hanganga he mapi irapoo o tenei ahuatanga nui o te miihini whakakoi kemu tangata.
Ko te SPACA6 he pūmua transmembrane kotahi-paahi me tetahi glycan hono-N me nga here disulfide putative e ono (Whakaahua S1a me S2).I whakapuakihia e matou te rohe extracellular o te SPACA6 tangata (te toenga 27-246) i roto i nga kamera Drosophila S2 me te purea i te pūmua ma te whakamahi i te hononga nickel, te whakawhitinga cation, me te chromatography whakakorenga rahi (Fig. S1b).Ko te SPACA6 ectodomain kua purea he tino pumau me te riterite.Ko te tātaritanga ma te whakamahi i te chromatography whakakore rahi me te whakamararatanga marama polygonal (SEC-MALS) i kitea he tihi kotahi me te taumaha ngota o te 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c).He rite tenei ki te rahi o te SPACA6 monomeric ectodomain, e tohu ana kaore i puta te oligomerization i te wa e purea ana.I tua atu, i whakaatuhia e te tirohanga awhiowhio porohita (CD) he hanganga α/β whakauru me te ira whakarewa o te 51.3 °C (Fig. S1d,e).Ko te whakakorenga o te hianga CD i whakaatu i te 38.6% α-helical me te 15.8% β-stranded huānga (Whakaahua S1d).
Ko te SPACA6 ectodomain i whakamaaramatia ma te whakamahi i te matrix matrix seeding38 ka puta he huinga raraunga me te taumira o te 2.2 Å (Ripanga 1 me te Whakaahua S3).Ma te whakamahi i te whakakotahitanga o te whakakapinga ngota i runga i te kongakonga me nga raraunga whakahiato SAD me te whakakitenga bromide mo te whakatau hanganga (Ripanga 1 me te Whakaahua S4), kei roto i te tauira parakore nga toenga 27-246.I te wa i whakatauhia te hanganga, kaore he hanganga whakamatautau, AlphaFold ranei e waatea ana.Ko te SPACA6 ectodomain te ine 20 Å × 20 Å × 85 Å, e whitu nga hiwi me nga whenu β e iwa, a, he riu tuatoru whakaroa kua whakapumauhia e nga here disulfide e ono (Fig. 1a, b).Ko te kiato irahiko ngoikore i te pito o te mekameka taha Asn243 e tohu ana ko tenei toenga he glycosylation hono-N.E rua nga waahanga o te hanganga: he paihere wha-helix-N-terminal (4HB) me te rohe C-terminal Ig-rite me te rohe hinge takawaenga i waenganui ia ratou (Fig. 1c).
he Hanganga o te rohe extracellular o SPACA6.Tihorea te hoahoa o te rohe taapiri o SPACA6, te tae o te mekameka mai i te N ki te pito-C mai i te puru pouri ki te whero pouri.Ko nga Cysteine ​​e uru ana ki nga here disulfide ka tohua ki te magenta.b Topology o te rohe extracellular o SPACA6.Whakamahia te kaupapa tae rite ki te Whakaahua 1a.c SPACA6 rohe taapiri.Ko te 4HB, te hinge, me te Ig-rite rohe he karaka, he karaka, he kahurangi hoki.Karekau nga paparanga e toia ki te tauine.
Kei roto i te rohe 4HB o SPACA6 nga helices matua e wha (helices 1-4), kua whakaritea i roto i te ahua o te helical helical (Fig. 2a), he rereke i waenga i nga taunekeneke antiparallel me te parallel (Fig. 2b).Ka whakatakotoria he tapatoru iti me nga topa 1 me te 2. Ko tenei tapatoru he ahua kino i roto i te tarapi kopikopiko o te tarapi ahua mato o nga topa 3 me te 4 ( Whakaahua 2a).
4HB T-tutohi tangohanga-N.b Tirohanga runga o te paihere o nga topa e wha, ia helix kua tohua ki te puru pouri ki te pito-N me te whero pouri ki te pito-C.c Hoahoa wira torino o runga-iho mo te 4HB, me ia toenga ka whakaatuhia hei porowhita kua tapaina ki te waehere waikawa amino reta kotahi;ko nga waikawa amino e wha anake kei runga o te wira ka tatauhia.Ko nga toenga kore-polar he kowhai te tae, ko nga toenga polar karekau he utu he kaakaariki, ko nga toenga pai i utaina he puru puru, a ko nga toenga kino he tae whero.d Nga mata tapatoru o te rohe 4HB, me nga 4HB ki te karaka me nga inihi ki te matomato.Ko nga whakauru e rua e whakaatu ana i nga here disulfide te ahua o te rakau.
Ko te 4HB kei runga i te uho hydrophobic o roto ka tito te nuinga o nga toenga aliphatic me nga toenga kakara (Fig. 2c).Kei roto i te matua he here disulfide i waenga i te Cys41 me te Cys55 e hono ana i nga helices 1 me te 2 ki roto i te tapatoru teitei ake (Fig. 2d).E rua atu nga here disulfide i hangaia i waenganui i te CXXC motif i Helix 1 'me tetahi atu CXXC motif i kitea i te pito o te β-hairpin i te rohe hinge (Fig. 2d).Kei roto i te tapatoru puapua he toenga arginine tiaki me te mahi kore mohiotia (Arg37) i hangaia e nga helices 1′, 1, me te 2. Ko nga ngota waro Aliphatic Cβ, Cγ, me Cδ Arg37 e pahekoheko ana me te uho hydrophobic, me ona roopu guanidine ka neke hurihiko. i waenganui i nga helices 1′ me te 1 ma te taunekeneke i waenga i te tuara Thr32 me te mekameka taha (Fig. S5a,b).Ka toro atu a Tyr34 ki roto i te rua ka mahue nga rua iti e taea ai e Arg37 te taunekeneke me te whakarewa.
Ko nga rohe β-sandwich rite-Ig he whanau nui o nga pūmua e tiritiri ana i te ahuatanga noa o te rua, neke atu ranei o nga pepa amphipathic β-pae maha e taunekeneke ana ma te matua hydrophobic. me nga papa e rua (Fig. S6a).Ko te rau 1 he β-pepa o nga whenu e wha (nga whenu D, F, H, me I) ka hangai nga whenu F, H, me au i te whakarite whakarara whakarara, ka uru nga whenu I me D ki te tauwhitinga whakarara.Ko te Ripanga 2 he pepa beta iti-whakarara whakarara (nga whenu E me G).I kitea he here disulfide o roto i waenga i te C-terminus o te mekameka E me te pokapū o te mekameka H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).He rite tenei here disulfide ki te here disulfide i roto i te rohe β-sandwich o immunoglobulin40,41.
Ko nga whenu β-sheet e wha ka huri i tona roa katoa, ka hanga i nga tapa hangarite he rereke te ahua me te hikohiko.Ko te taha angiangi he mata taiao hydrophobic papatahi e tu atu ana ki te toenga o nga mata koretake me te rereke hiko i roto i te SPACA6 (Fig. S6b,c).He karu o nga roopu carbonyl/amino tuara e kitea ana me nga mekameka taha polar e karapoti ana i te mata hydrophobic (Fig. S6c).Ko te taha whanui ka hipokina e tetahi waahanga helical kapi e aukati ana i te waahanga-N o te matua hydrophobic me te hanga i nga here hauwai e toru me te roopu polar tuwhera o te tuara mekameka F (Fig. S6d).Ko te waahanga C-terminal o tenei taha ka hanga he pute nui me tetahi waahanga hydrophobic kua kitea.Ko te pute e karapotia ana e nga utu pai na te toru huinga o nga toenga arginine rua (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 me Arg212-Arg214) me te histidine pokapū (His220) (Whakaahua S6e).
Ko te rohe hinge he wahanga poto i waenganui i te rohe helical me te rohe rite-Ig, kei roto i tetahi paparanga β-whaa-toru-a-te-parallel (nga whenu A, B me C), he iti 310 helix, me etahi waahanga helical matapōkere roa.(Whakaahua S7).Ko te kupenga o nga hononga kovalent me te hiko i roto i te rohe hinge ka puta ki te whakapumau i te takotoranga i waenga i te 4HB me te rohe rite-Ig.Ka taea te wehewehe i te whatunga kia toru nga waahanga.Kei roto i te waahanga tuatahi nga kaupapa CXXC e rua (27CXXC30 me 139CXXC142) e hanga ana i nga hononga disulfide takirua i waenga i te β-hairpin i roto i te hinge me te 1′ helix i 4HB.Ko te waahanga tuarua ko nga taunekeneke hiko i waenga i te rohe rite Ig me te hinge.Ko Glu132 i roto i te hinge ka hanga he piriti tote me Arg233 i roto i te rohe rite Ig me Arg135 i roto i te hinge.Kei roto i te wahanga tuatoru he here kovalent i waenga i te rohe rite-Ig me te rohe hinge.E rua nga here disulfide (Cys124-Cys147 me Cys128-Cys153) e hono ana i te kowiri hinge ki te hono e whakapumautia ana e nga tauwhitinga hiko i waenga i te Gln131 me te roopu mahi tuara, ka taea te uru atu ki te rohe rite-Ig tuatahi.mekameka.
I whakamahia te hanganga o te SPACA6 ectodomain me nga hanganga takitahi o te 4HB me te Ig-rite ki te rapu i nga rekoata rite tonu i roto i nga papaarangi pūmua 42.I tautuhia e matou nga whakataetae me nga kaute Dali Z teitei, nga rereketanga paerewa iti, me nga kaute LALI nui (ko te mea whakamutunga ko te maha o nga toenga hanganga rite).Ahakoa ko nga 10 tuatahi mai i te rapunga ectodomain katoa (Ripanga S1) he tohu-Z e pai ana ki te >842, he rapunga mo te rohe 4HB, Ig-rite anake i whakaatu ko te nuinga o enei whiu e hono ana ki te β-sandwich anake.he kopaki kei nga waahi katoa ka kitea i roto i te maha o nga pūmua.Ko nga rapunga e toru i Dali kotahi anake te hua: IZUMO1.
Kua roa te whakaaro ko te SPACA6 me te IZUMO1 he rite nga hanganga hanganga7,32,37.Ahakoa ko nga ectodomains o enei pūmua e rua e hono ana ki te fusion gamete he 21% anake te tuakiri raupapa (Whakaahua S8a), he taunakitanga matatini, tae atu ki te tauira herenga disulfide kua tiakina me tetahi rohe C-terminal Ig-rite i roto i te SPACA6, i whakaaetia nga ngana wawe ki te hanga tauira homology o A a SPACA6 kiore e whakamahi ana i te IZUMO1 hei tauira37.Ka whakamanahia e to maatau hanganga enei matapae me te whakaatu i te tino tohu o te rite.Ko te tikanga, ko nga hanganga SPACA6 me IZUMO137,43,44 he rite tonu te hoahoanga-rua (Fig. S8b) me nga rohe rite 4HB me te Ig-like β-sandwich e honoa ana e te rohe hinge (Fig. S8c).
IZUMO1 me SPACA6 4HB he rereke noa mai i nga paihere torino tikanga.Ko nga 4HB angamaheni, penei i nga mea e kitea ana i roto i nga huinga pūmua SNARE e uru ana ki te whakakotahitanga endosomal 45,46, he riterite te mokowhiti o nga helices e pupuri ana i te kopikopiko tonu huri noa i te tuaka pokapū 47. Engari, ko nga rohe helical i roto i te IZUMO1 me te SPACA6 i kopikopiko, me te rereke rereke me te rereke. takai koretake (Whakaahua S8d).Ko te kopikopiko, na te tapatoru i hanga e te helices 1′, 1 me te 2, ka mau tonu ki te IZUMO1 me te SPACA6 me te whakapumau i te kaupapa CXXC ano i runga i te helix 1′.Heoi, ko te herenga disulfide taapiri e kitea ana i roto i te SPACA6 (Cys41 me Cys55 e hono ana i nga helices 1 me te 2 i runga ake nei) ka hanga he pito koi ki te tihi tapatoru, na te SPACA6 he kopikopiko ake i te IZUMO1, he nui ake te whakahua o nga tapatoru kohao.I tua atu, IZUMO1 kore Arg37 kitea i roto i te pokapū o tenei kōhao i roto i SPACA6.He rereke, ko te IZUMO1 he ahua nui ake o te hauwai o nga toenga aliphatic me te kakara.
Kei a IZUMO1 he rohe rite-Ig kei roto he β-sheet43 nga whenu-rua me te pae-rima.Ko te whenu taapiri i roto i te IZUMO1 ka whakakapi i te porowhita i SPACA6, ka mahi tahi me te whenu F hei whakatiki i nga here hauwai tuara i roto i te whenu.He mea whakamere ki te whakataurite ko te utu matapae o nga rohe rite Ig o nga pūmua e rua.Ko te mata IZUMO1 he nui ake te utu kino atu i te mata SPACA6.He utu taapiri kei te tata ki te C-terminus e anga atu ana ki te kiriuhi parāoa.I roto i te SPACA6, ko nga rohe ano he koretake, he pai te utu ranei (Fig. S8e).Hei tauira, ko te mata hydrophobic (te taha angiangi) me nga rua pai te utu (te whanui ake) i roto i te SPACA6 he kino ki te IZUMO1.
Ahakoa he pai te tiaki i nga hononga me nga waahanga hanganga tuarua i waenga i te IZUMO1 me te SPACA6, ko te hanganga o nga waahi-rite-Ig i whakaatu he rereke nga waahanga e rua i roto i to raatau tikanga whanui e pa ana ki a ratau (Fig. S9).Ko te paihere torino o IZUMO1 he kopikopiko mo te β-sandwich, ka hanga i te ahua "boomerang" i whakaahuatia i mua tata ki te 50° mai i te tuaka pokapū.He rereke, ko te kurupae helical i roto i te SPACA6 i tio tata ki te 10° ki te huarahi ke.Ko nga rereketanga i roto i enei tuunga na te rereketanga o te rohe hinge.I te taumata raupapa tuatahi, ko te IZUMO1 me te SPACA6 te wehewehe i te ahua o te raupapa i te hinge, haunga te cysteine, glycine, me te toenga waikawa aspartic.Ko te mutunga, he tino rereke nga here hauwai me nga whatunga hiko.Ko nga huānga hanganga tuarua β-sheet e tohatohahia ana e IZUMO1 me SPACA6, ahakoa he roa ake nga mekameka i roto i te IZUMO1 me te 310 helix (helix 5) he mea motuhake ki a SPACA6.Ko enei rereketanga ka puta he rereke nga whakatakotoranga rohe mo nga pūmua rereke e rua.
I kitea e ta maatau kaitirotiro a Dali ko SPACA6 me IZUMO1 anake nga hanganga e rua kua whakatauhia i roto i te putunga purongo e mau ana tenei waahanga 4HB (Ripanga S1).Ina tata nei, kua whakawhanakehia e DeepMind (Alphabet/Google) a AlphaFold, he punaha i runga i te whatunga neural ka taea te matapae tika i nga hanganga 3D o nga pūmua mai i nga raupapa tuatahi48.I muri tata mai i to maatau whakaoti i te hanganga SPACA6, i tukuna te papaunga raraunga AlphaFold, e whakarato ana i nga tauira hanganga matapae e hipoki ana i te 98.5% o nga pūmua katoa i roto i te proteome48,49 tangata.Ma te whakamahi i to maatau hanganga SPACA6 kua whakatauhia hei tauira rapu, he rapu homology hanganga mo te tauira i roto i te AlphaFold proteome tangata i tautuhia nga kaitono me nga ahuatanga o te hanganga ki a SPACA6 me IZUMO1.I runga i te tino tika o AlphaFold ki te tohu i te SPACA6 (Fig. S10a) -ina koa ko te 1.1 Å rms ectodomain i whakaritea ki to maatau hanganga kua whakatauhia (Fig. S10b) - ka taea e matou te maia ka tika nga whakataetae SPACA6 kua tautuhia.
I mua, i rapuhia e te PSI-BLAST te kohinga IZUMO1 me etahi atu pūmua e toru e pa ana ki te sperm: IZUMO2, IZUMO3, me IZUMO450.I matapaetia e AlphaFold ko enei porotini whanau IZUMO ka uru ki roto i te rohe 4HB me te tauira here disulfide rite ki te IZUMO1 (Whakaahua 3a me S11), ahakoa karekau he rohe rite Ig.Kei te whakapaehia ko IZUMO2 me IZUMO3 he pūmua membrane kotahi-taha rite ki te IZUMO1, i te mea ko IZUMO4 te ahua kei te huna.Ko nga mahi o te IZUMO 2, 3, me te 4 pūmua i roto i te whakakotahitanga gamete kaore i whakatauhia.Ko te IZUMO3 e mohiotia ana he mahi i roto i te acrosome biogenesis i te wa o te whanaketanga parāoa51 a kua kitea te pūmua IZUMO ki te hanga matatini50.Ko te tiaki i nga pūmua IZUMO i roto i nga kararehe whakangote, ngarara, me nga amphibians e kii ana ko o raatau mahi ka rite ki era atu o nga pūmua e pa ana ki te gamete-fusion, penei i te DCST1/2, SOF1, me te FIMP.
Hoahoa o te hoahoanga rohe o te IST superfamily, me nga rohe 4HB, hinge, me te Ig-rite kua tohua ki te karaka, te kaariki, me te puru.Kei a IZUMO4 tetahi rohe C-terminal motuhake he pango te ahua.Ko nga herenga disulfide kua whakapumautia me te putative e whakaatuhia ana e nga raina totoka me nga raina iraira.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-EMF9), (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-EMF9) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) ka whakaatuhia i roto i te awhe tae rite ki te panui A. Ka whakaatuhia nga here disulfide ki te magenta.TMEM95, IZUMO2 me IZUMO3 transmembrane helices e kore e whakaatuhia.
Kaore i rite ki te pūmua IZUMO, ko etahi atu pūmua SPACA (arā, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, me SPACA9) e whakaarohia ana he rereke te hanganga mai i te SPACA6 (Fig. S12).Ko SPACA9 anake te 4HB, engari karekau e whakaaro kia rite te nohonga whakarara-anti-whakarara me te herenga disulfide rite ki a SPACA6.Ko SPACA1 anake he rohe rite Ig.E matapae ana a AlphaFold ko te SPACA3, SPACA4 me SPACA5 he tino rereke te hanganga i te SPACA6.Ko te mea whakamiharo, ko te SPACA4 e mohiotia ana he mahi ki te whakakikiritanga, engari he nui ake i te SPACA6, engari ko te whakahaere i te taunekeneke i waenga i te sperm me te oocyte zona pellucida52.
I kitea e ta maatau rapu AlphaFold tetahi atu whakataetae mo IZUMO1 me SPACA6 4HB, TMEM95.Ko te TMEM95, he pūmua transmembrane sperm-specific kotahi, ka kore nga kiore tane i te wa e whakahekehia ana te 32,33.Ko te Spermatozoa e ngaro ana i te TMEM95 he ahua noa, motility, me te kaha ki te kuhu ki te zona pellucida me te here ki te kiri o te hua manu, engari kaore e taea te hono ki te membrane oocyte.Kua whakaatuhia e nga rangahau o mua ko te TMEM95 he rite nga hanganga me te IZUMO133.Ae, i whakapumautia e te tauira AlphaFold ko te TMEM95 he 4HB me te rua o nga kaupapa CXXC rite ki te IZUMO1 me te SPACA6 me te hononga taapiri disulfide i waenga i nga helices 1 me te 2 i kitea i roto i te SPACA6 (Fig. 3a me S11).Ahakoa te kore o TMEM95 he rohe rite Ig, he rohe kei roto i te tauira here disulfide e rite ana ki nga rohe hinge SPACA6 me IZUMO1 (Fig. 3b).I te wa o te whakaputanga o tenei tuhinga, i kii te kaitoro o mua i te hanganga o TMEM95, e whakau ana i te hua AlphaFold53.He tino rite te TMEM95 ki te SPACA6 me te IZUMO1, a, kua tipuhia i roto i nga amphibians (Fig. 4 me S13).
I whakamahia e te rapunga PSI-BLAST te NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, me te SOF1 papaarangi hei whakatau i te waahi o enei raupapa i roto i te rakau o te ora.Ko nga tawhiti i waenga i nga tohu peka kaore e whakaatuhia ki te tauine.
Ko te tino rite o te hanganga i waenga i te SPACA6 me te IZUMO1 e kii ana kei te whakatuu mema ratou o te whanau nui o te hanganga kua tiakina kei roto ko te TMEM95 me te IZUMO 2, 3, me te 4 nga pūmua.nga mema e mohiotia ana: IZUMO1, SPACA6 me TMEM95.No te mea he tokoiti noa nga mema e mau ana i nga rohe rite-Ig, ko te tohu o te whanau nui o IST ko te rohe 4HB, he ahuatanga ahurei e rite ana ki enei pūmua katoa: 1) Ko te 4HB kua kohia me nga heliki kua whakaritea i roto i te rereke whakarara/whakarara (Fig . 5a), 2) he mata tapatoru te paihere kei roto e rua nga helices i roto i te paihere me te tuatoru poutū helix (Fig. rohe matua (Fig. 5c). Ko te motif CXXC, i kitea i roto i te thioredoxin-like proteins, e mohiotia ana ki te mahi. hei pūoko redox 54,55,56, i te mea ko te motif i roto i nga mema o te whanau IST ka taea te hono ki nga isomerases disulfide pūmua penei i te ERp57 i roto i te whakakotahitanga gamete.
Ko nga mema o te whanau nui o te IST e tohuhia ana e nga ahuatanga e toru o te rohe 4HB: e wha nga helices e taurite ana i waenga i te tuunga whakarara me te whakarara, nga mata paihere helical ba-triangular, me te ahua takirua ca CXXC i hangaia i waenga i nga ngota ngota iti.) Helixes-N (karaka) me te rohe hinge β-hairpin (matomato).
I runga i te ahua o te SPACA6 me te IZUMO1, i whakamatauhia te kaha o te mua ki te here ki te IZUMO1, ki te JUNO ranei.Ko te biolayer interferometry (BLI) he tikanga here-a-kinetic kua whakamahia i mua ki te tatau i te taunekeneke i waenga i te IZUMO1 me JUNO.I muri i te whakapouritanga o te tohu tohu-koiora me te IZUMO1 hei maunu me te nui o te kukū o te JUNO analyte, i kitea he tohu kaha (Fig. S14a), e tohu ana i te huringa here-whakauru i te matotoru o te koiora e piri ana ki te pito o te puoro.He rite nga tohu (ara, JUNO i honoa ki te pukoro hei maunu ki te IZUMO1 analyte) (Fig. S14b).Karekau he tohu i kitea i te wa i whakamahia ai a SPACA6 hei wetewete ki te IZUMO1, ki te JUNO kua herea ki te sensor (Whakaahua S14a,b).Ko te kore o tenei tohu e tohu ana ko te rohe extracellular o SPACA6 e kore e taunekeneke ki te rohe extracellular o IZUMO1 ranei JUNO.
Na te mea ko te whakamatautau BLI i runga i te biotinylation o nga toenga lysine kore utu i runga i te pūmua maunu, ka taea e tenei whakarereketanga te aukati i te here mena ka uru nga toenga lysine ki te taunekeneke.I tua atu, ko te takotoranga o te hononga hono ki te pukoro ka taea te hanga i nga aukati, na reira i mahia ano nga whakamatautau whakaheke-iho i runga i nga recombinant SPACA6, IZUMO1 me JUNO ectodomains.Ahakoa tenei, kaore a SPACA6 i pupuhi me tana IZUMO1, tana tohu JUNO ranei (Fig. S14c, d), e tohu ana kaore he taunekeneke e rite ana ki tera i kitea i roto i nga whakamatautau BLI.Hei whakahaere pai, i whakapumautia e matou te taunekeneke a JUNO me te tapanga i tana IZUMO1 (Whakaahua S14e me S15).
Ahakoa te ahua o te hanganga i waenga i te SPACA6 me te IZUMO1, ko te kore o te SPACA6 ki te here i a JUNO ehara i te mea miharo.Ko te mata o te tangata IZUMO1 he nui ake i te 20 nga toenga e taunekeneke ana ki a JUNO, tae atu ki nga toenga mai i ia rohe e toru (ahakoa ko te nuinga o ratou kei roto i te rohe hinge) (Fig. S14f).O enei toenga, kotahi anake ka tiakina i roto i te SPACA6 (Glu70).Ahakoa te maha o nga toenga whakakapinga i pupuri i o raatau ahuatanga koiora taketake, ko te toenga Arg160 nui i roto i te IZUMO1 i whakakapihia e te Asp148 kino i roto i te SPACA6;kua whakaatuhia e nga rangahau o mua ko te whakarereketanga o Arg160Glu i IZUMO1 ka tata te whakakore i te here ki a JUNO43.I tua atu, ko te rereketanga o te whakatakotoranga rohe i waenga i te IZUMO1 me te SPACA6 i tino piki ake te mata o te waahi JUNO-here o te rohe rite i runga i te SPACA6 (Fig. S14g).
Ahakoa te hiahia mo te SPACA6 mo te whakakotahitanga gamete me tona rite ki te IZUMO1, karekau he mahi here JUNO rite tonu a SPACA6.Na reira, i whai matou ki te whakakotahi i o matou raraunga hanganga me nga taunakitanga hiranga i whakaratohia e te koiora kukuwhatanga.Ko te raupapa raupapa o nga homologues SPACA6 e whakaatu ana i te tiaki i te hanganga noa atu i tua atu o nga whangote.Hei tauira, kei te noho tonu nga toenga cysteine ​​ahakoa i roto i nga amphibians tawhiti (Fig. 6a).Ma te whakamahi i te tūmau ConSurf, he maha nga raraunga pupuri raupapa raupapa o nga raupapa 66 i mapi ki te mata SPACA6.Ka taea e tenei momo tātaritanga te whakaatu ko wai nga toenga i tiakina i te wa o te kunenga o te pūmua me te tohu ko wai nga rohe mata e whai waahi ana ki te mahi.
he raupapatanga raupapa o nga SPACA6 ectodomains mai i nga momo momo 12 i whakaritea ma te whakamahi i te CLUSTAL OMEGA.E ai ki te tātaritanga a ConSurf, ko nga tuunga tino atawhai ka tohua ki te puru.Ko nga toenga Cysteine ​​​​e tohuhia ana ki te whero.Ko nga rohe rohe me nga huānga hanganga tuarua e whakaatuhia ana ki te tihi o te tirohanga, kei reira nga pere e tohu ana i nga whenu-β me nga ngaru e tohu ana i nga helices.Ko te NCBI Access Identifiers kei roto nga raupapa ko: tangata (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), makimaki capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), hoiho (Equus caballus, XP2_02rcallus, XP_01821277) 3 XP_032_034) .), hipi (Ovis aries, XP_014955560), arewhana (Loxodonta africana, XP_010585293), kuri (Canis lupus familyis, XP_025277208), kiore (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil (S3081) ypus, 8) , 61_89 me Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Ko te tatauranga i runga i te raupapa tangata.b Te ahua o te mata o te hanganga SPACA6 me te 4HB ki runga me te rohe rite Ig ki raro, nga tae i runga i nga whakatau tata tiaki mai i te tūmau ConSurf.Ko nga waahanga pai rawa atu he puru, ko nga waahanga kua tiakina he ma, ko nga mea iti rawa he kowhai.cystine papura.E toru nga papanga mata e whakaatu ana i te taumata teitei o te whakamarumaru e whakaatuhia ana i roto i te whakaurunga e tapaina ana ki nga papanga 1, 2 me te 3. Ka whakaatuhia he pakiwaituhi 4HB ki te whakauru i te taha matau o runga (he kaupapa tae kotahi).
Ko te hanganga SPACA6 e toru nga rohe mata tino tiakina (Fig. 6b).Ko te Patch 1 kei roto i te 4HB me te rohe hinge, kei roto e rua nga piriti CXXC disulfide kua tiakina, he kupenga hinge Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7), me nga toenga kakara o waho e tiakina ana (Phe31, Tyr73, Phe137)).he awhi whanui ake o te rohe rite-Ig (Fig. S6e), e tohu ana i te maha o nga toenga pai ki runga i te mata parāoa.He mea whakamiharo, kei roto i tenei papaki he epitope antibody kua whakaatuhia i mua ki te whakararu i te mahi SPACA6 30.Ko te Rohe 3 ka horahia te hinge me tetahi taha o te rohe rite-Ig;kei roto i tenei rohe nga proline kua tiakina (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) me nga toenga polar/whakahaa ki waho.Ko te mea whakamiharo, ko te nuinga o nga toenga kei runga i te mata o te 4HB he tino rerekee (Fig. 6b), ahakoa kei te tiakina te kopaki puta noa i te homologue SPACA6 (e tohuhia ana e te conservatism o te matua paihere hydrophobic) me tua atu o te IST superfamily.
Ahakoa koinei te rohe iti rawa i roto i te SPACA6 me te iti rawa o nga huānga hanganga tuarua e kitea ana, he maha nga toenga o te rohe hinge (tae atu ki te rohe 3) e tino tiakina ana i waenga i nga homologues SPACA6, tera pea ka tohu ko te tuunga o te paihere helical me te β-sandwich he mahi.hei kaitiaki.Heoi, ahakoa te nui o nga hononga hauwai me nga hononga hiko i roto i te rohe hinge o SPACA6 me IZUMO1, ka kitea nga taunakitanga o te ngawari o roto i te whakahoatanga o nga hanganga maha kua whakaaetia o IZUMO137,43,44.He pai te whitinga o nga rohe takitahi, engari ko te takotoranga o nga rohe e pa ana ki a raatau ano he rereke mai i te 50° ki te 70° mai i te tuaka pokapū (Fig. S16).Kia mohio ai koe ki nga ahuatanga o te SPACA6 i roto i te otinga, i mahia nga whakamatautau SAXS (Fig. S17a, b).Ab initio reconstruction o te SPACA6 ectodomain rite ki te hanganga karaihe tokotoko (Fig. S18), ahakoa i whakaatu te mahere Kratky etahi tohu o te ngawari (Fig. S17b).He rereke tenei ahua ki te IZUMO1, ko te pūmua kore i herea he ahua boomerang i roto i te mahanga me te otinga43.
Hei tautuhi motuhake i te rohe ngawari, i mahia te hiko-deuterium exchange mass spectroscopy (H-DXMS) i runga i te SPACA6 me te whakataurite ki nga raraunga i whiwhi i mua i runga i te IZUMO143 (Fig. 7a,b).Ko te SPACA6 he maamaa ake i te IZUMO1, e whakaatuhia ana e te nui o te whakawhitinga deuterium puta noa i te hanganga i muri i te 100,000 s o te whakawhiti.I roto i nga hanganga e rua, ko te waahanga C-terminal o te rohe hinge e whakaatu ana i te taumata teitei o te whakawhiti, ka taea pea te iti o te hurihanga o nga rohe 4HB me te Ig-rite ki a raatau.He mea whakamiharo, ko te waahanga C-terminal o te hinge SPACA6, kei roto ko te toenga 147CDLPLDCP154, he rohe tino tiakina 3 (Fig. 6b), e tohu ana pea ko te ngawari o te interdomain he ahuatanga kua tiakina e te SPACA6.E ai ki te tātaritanga ngawari, i whakaatu nga raraunga rewa CD waiariki ko te SPACA6 (Tm = 51.2°C) he iti ake te pumau i te IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (Fig. S1e me S19).
he whakaahua H-DXMS o SPACA6 me b IZUMO1.Ko te paheketanga o te whakawhitinga deuterium i whakatauhia i nga waahi kua tohua.Ko nga taumata o te whakawhiti hauwai-deuterium e tohuhia ana e te tae i runga i te tauine rōnaki mai i te kahurangi (10%) ki te whero (90%).Ko nga pouaka pango e tohu ana i nga waahi utu nui.Ko nga rohe o 4HB, hinge me te rohe rite Ig i kitea i roto i te hanganga karaihe e whakaatuhia ana i runga ake i te raupapa tuatahi.Ko nga taumata whakawhiti Deuterium i te 10 s, 1000 s, me te 100,000 s i whakatakotohia ki runga i te tūtohi takai kua whakakikoruatia ki runga i nga mata rapoi maramara o SPACA6 me IZUMO1.Ko nga waahanga o nga hanganga me te taumata whakawhiti deuterium i raro i te 50% he ma te tae.Ko nga waahi kei runga ake i te 50% H-DXMS whakawhitinga he kara ki te tauine rōnaki.
Na te whakamahi i nga rautaki ira ira ira CRISPR/Cas9 me te kiore kiore i kitea he maha nga mea nui mo te here me te whakakotahitanga o te parāoa me te hua manu.I tua atu i te pai o te taunekeneke o te IZUMO1-JUNO me te hanganga CD9, ko te nuinga o nga pūmua e pa ana ki te whakakotahitanga o te gamete ka noho tonu te hangahanga me te mahi enigmatic.Ko te tohu koiora me te hanganga o te SPACA6 tetahi atu waahanga o te panga rapoi adhesion/fusion i te wa whakakikiritanga.
Ko te SPACA6 me etahi atu mema o te whanau nui o te IST te ahua e tino tiakina ana i roto i nga kararehe whakangote tae atu ki nga manu takitahi, nga ngarara, me nga amphibians;Inaa ra, ko te whakaaro ko te SPACA6 e hiahiatia ana mo te whakakikiritanga i roto i nga ika zebrafish 59. He rite tenei tohatoha ki etahi atu pūmua e mohiotia ana e hono ana ki te whakahiato gamete penei i te DCST134, DCST234, FIMP31, me te SOF132, e kii ana ko enei mea he HAP2-kore (ano hoki). e mohiotia ana ko GCS1) nga pūmua he kawenga mo te mahi catalytic o te maha o nga protist., tipu, me te angawaho.Ko nga pūmua whakakoi wairakau 60, 61. Ahakoa te kaha o te ahua o te hanganga i waenga i te SPACA6 me te IZUMO1, ko te patototanga o nga ira ira e whakawaehere ana i tetahi o enei pūmua i hua ki te kore tamariki i roto i nga kiore tane, e tohu ana ko o raatau mahi i roto i te whakakotahitanga gamete kaore i te takirua..I te whanuitanga atu, karekau tetahi o nga pūmua parāoa e mohiotia ana e hiahiatia ana mo te wahanga piri o te hanumi e kore e ngaro.
He patai tuwhera tonu mena ka uru atu a SPACA6 (me etahi atu mema o te IST superfamily) ki nga hononga i waenga i nga keemu, ka hanga i nga whatunga intragametic ki te tango i nga pūmua nui ki nga tohu whakakotahi, me te mahi ano he fusogens uaua.Ko nga rangahau-a-immunoprecipitation i roto i nga pūtau HEK293T i kitea he taunekeneke i waenga i te roa o te IZUMO1 me te SPACA632.Engari, kaore o maatau ectodomains recombinant i taunekeneke i roto i te vitro, e kii ana ko nga taunekeneke e kitea ana i Noda et al.i mukua e rua i roto i te hanga (tuhia te hiku cytoplasmic o IZUMO1, kua whakaatuhia he kore e tika mo te whakakikiritanga62).Ko te tikanga, ka hiahia pea a IZUMO1 me/ranei SPACA6 i nga taiao herenga motuhake e kore e mahia e tatou i roto i te vitro, penei i nga hanganga-a-tinana-a-tinana, i nga matatini rapoi kei roto etahi atu pūmua (mohiotia, kaore ano kia kitea).Ahakoa e whakaponohia ana ko te IZUMO1 ectodomain hei takawaenga i te whakapiringa o te spermatozoa ki te hua manu i te waahi perivitelline, kaore i te maarama te kaupapa o te SPACA6 ectodomain.
Ko te hanganga o SPACA6 e whakaatu ana i te maha o nga waahi kua tiakina ka uru pea ki nga taunekeneke pūmua-pūmua.Ko te wahanga tiaki o te rohe hinge e tata tonu ana ki te kaupapa CXXC (kua tohua te Patch 1 kei runga ake) he maha nga toenga kakara e anga atu ana ki waho e hono ana ki nga taunekeneke hydrophobic me te π-stacking i waenga i te koiora.Ko nga taha whanui o te rohe rite-Ig (rohe 2) ka hanga i te awaawa pai ki te pupuri i te Arg me ona toenga, a kua whakamahia nga paturopi ki tenei rohe i mua ki te aukati i te whakakotahitanga gamete 30.E mohio ana te antibody ki te epitope raina 212RIRPAQLTHRGTFS225, e toru o nga toenga arginine e ono me te tino tiaki i a His220.Kaore i te maarama mena na te aukatinga o enei toenga motuhake, te rohe katoa ranei.Ko te waahi o tenei waahi e tata ana ki te C-terminus o te β-sandwich e tohu ana i nga taunekeneke-cis me nga pūmua parāoa tata, engari kaua ki nga pūmua oocyte.I tua atu, ko te pupuritanga o te taruke (pae 3) i roto i te hinge ko te waahi o te pahekoheko pūmua-pūmua, he tohu pea te pupuri i te ngawari i waenga i nga rohe e rua.He mea nui te ira tangata mo te mahi kore mohiotia a SPACA6.te whakakotahitanga o nga kemu.
Kei a SPACA6 nga ahuatanga o nga pūmua adhesion intercellular, tae atu ki te Ig-like β-sandwiches.He maha nga pūmua piri (hei tauira, cadherins, integrins, adhesins, me IZUMO1) kei a ratou tetahi, neke atu ranei nga rohe β-sandwich e toro atu ana i nga pūmua mai i te membrane pūtau ki o ratou taumata taiao63,64,65.Kei roto i te rohe rite-Ig o SPACA6 tetahi kaupapa e kitea ana i roto i nga β-sandwiches o te piri me te whakakotahitanga: nga taarua o nga whenu whakarara i nga pito o te β-sandwiches, e kiia ana he rawhi miihini66.E whakaponohia ana ko tenei kaupapa ka whakanui ake i te parenga ki nga kaha kutikuti, he mea nui mo nga pūmua e uru ana ki nga taunekeneke i waenga i nga waea.Heoi, ahakoa tenei ahua rite ki nga adhesins, i tenei wa karekau he taunakitanga e mahi tahi ana a SPACA6 me nga maa hua manu.Kaore e taea e te SPACA6 ectodomain te here ki a JUNO, me nga pūtau HEK293T e whakaatu ana i te SPACA6, e whakaatuhia ana i konei, he uaua ki te mahi tahi me nga oocytes kaore he zona 32.Mēnā ka whakaūngia e te SPACA6 ngā herenga tauwhitiwhiti, ka hiahia pea enei taunekeneke ki te whakarereke i muri i te whakamaoritanga, me whakau ranei e etahi atu pūmua parāoa.Hei tautoko i te whakapae whakamutunga, ka herea te spermatozoa IZUMO1-kore ki nga oocytes, e whakaatu ana ko nga ngota i tua atu i te IZUMO1 e uru ana ki te taahiraa 27 adhesion gamete.
He maha nga pūmua whakakorikori huaketo, pūtau, me te whakawhanaketanga o te whakakotahitanga he taonga e tohu ana i a raatau mahi hei fusogens.Hei tauira, ko nga glycoproteins fusion viral (nga karaehe I, II me III) he peptide fusion hydrophobic ranei i te pito o te pūmua ka whakauruhia ki roto i te membrane ope.Ko te mahere hydrophilicity o IZUMO143 me te hanganga (kua whakatauhia me te matapae) o te IST superfamily kaore i kitea he peptide whakakotahitanga hydrophobic.No reira, ki te mahi etahi pūmua i roto i te IST superfamily hei fusogens, he rereke te mahi mai i etahi atu tauira e mohiotia ana.
Hei mutunga, ko nga mahi a nga mema o te IST superfamily o nga pūmua e pa ana ki te whakakotahitanga gamete ka noho tonu hei mea ngaro.Ko ta maatau mootaki whakahiato SPACA6 me tana hanganga kua whakatauhia ka maarama ki nga hononga i waenga i enei hanganga tiritahi me o raatau mahi ki te taapiri gamete me te whakakotahitanga.
Ko te raupapa DNA e rite ana ki te ectodomain SPACA6 tangata i matapaetia (te nama whakaurunga NCBI NP_001303901.1; toenga 27-246) he codon-optimized mo te whakahuatanga i roto i nga ruma Drosophila melanogaster S2 ka whakahiatohia hei wahanga ira me te raupapa whakawaehere Kozak (Eurofins Genomics)., ko te tohu hunanga BiP me te 5' me te 3' e rite ana ka mutu mo te whakakorikori here-motuhake o tenei ira ki roto i te vector whakaaturanga pMT i runga i te kaiwhakatairanga metallothionein kua whakarerekehia mo te kowhiringa me te puromycin (pMT-puro).Ko te vector pMT-puro e whakawaehere ana i te waahi wehenga o te thrombin me te tohu tohu 10x-Tona C-terminal (Whakaahua S2).
Ko te whakawhitinga pumau o te SPACA6 pMT-puro vector ki D. melanogaster S2 (Gibco) pūtau i mahia rite ki te kawa i whakamahia mo IZUMO1 me JUNO43.Ko nga pūtau S2 i whakamarokehia, ka whakatipuhia ki te reo o Schneider (Gibco) ka taapirihia ki te kukū whakamutunga o te 10% (v/v) te wera o te kuao kau (Gibco) me te 1X antimycotic antibiotic (Gibco).I whakakikoruatia nga pūtau whiti tuatahi (3.0 x 106 pūtau) ki roto i nga puna takitahi o nga pereti 6-puna (Corning).I muri i nga haora 24 o te incubation i te 27 ° C, ka whakawhitihia nga ruma me te ranunga o te 2 mg o te SPACA6 pMT-puro vector me te Effectene transfection reagent (Qiagen) e ai ki te kawa o te kaihanga.Ko nga pūtau kua whakawhitia kua whakakorohia mo te 72 haora ka hauhake ki te 6 mg/ml puromycin.Ka wetewetehia nga pūtau mai i te tikanga a Schneider ka tuu ki roto i te reo Insect-XPRESS kore-serum (Lonza) mo te hanga pūmua nui.He puranga 1 L o te ahurea pūtau S2 i whakatipuhia ki te 8–10 × 106 ml-1 nga pūtau i roto i te 2 L whakahaehae papatahi-raro polypropylene Erlenmeyer ipu katahi ka whakahoroa ki te kukū whakamutunga o te 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) me te tātari parakore.whakaawe.Ko nga ahurea i whakapourihia i te 27° C. i te 120 rpm mo nga ra e wha.
Ko te reo whakamaarama kei roto SPACA6 i wehea e te centrifugation i te 5660×g i te 4°C ka whai i te punaha filtration rere tatai Centramate (Pall Corp) me te 10 kDa MWCO membrane.Hoatuhia te reo kukū kei roto SPACA6 ki te 2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen) tīwae.I horoia te kapia Ni-NTA me nga pukapuka 10 pou (CV) o te kaitapa A, katahi ka tapirihia te 1 CV o te kaitapa A kia hoatu he kuhanga imidazole whakamutunga o te 50 mM.I whakakorehia te SPACA6 me te 10 ml o te buffer A i taapirihia ki te imidazole ki te kukū whakamutunga o te 500 mM.Ko te thrombin karaehe here (Millipore Sigma) i honoa tika atu ki te ngongo whakamaarama (MWCO 12-14 kDa) i te 1 wae mo ia mg SPACA6 ki te 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 me te 150 mM NaCl (buffer B) mo te whakaheke toto.) i te 4°C mo te 48 haora.Ko te SPACA6 kua werohia te thrombin ka toru nga waahanga hei whakaiti i te kukū o te tote, ka utaina ki runga i te 1 ml MonoS 5/50 GL cation exchange column (Cytiva/GE) e rite ana ki te 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.I horoia te kaitahuri cation ki te 3 CV o 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, katahi ka whakahekehia te SPACA6 me te rōnaki raina o te 0 ki te 500 mM NaCl i te 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 mo te 25 CV.Whai muri i te chromatography whakawhiti katote, i whakakorikoria te SPACA6 ki te 1 ml ka whakahekehia mai i te ENrich SEC650 10 x 300 tīwae (BioRad) i whakaōritea ki te buffer B. E ai ki te chromatogram, poka wai me nga hautau concentrate kei roto SPACA6.Ko te ma i whakahaeretia e Coomassie-stained electrophoresis i runga i te 16% SDS-polyacrylamide gel.Ko te kukū o te pūmua i ine i te horonga i te 280 nm ma te whakamahi i te ture Beer-Lambert me te whakarea molar molar.
Ko te SPACA6 kua purea i te po i te po ki te 10 mM konutai phosphate, te pH 7.4 me te 150 mM NaF ka diluted ki te 0.16 mg/mL i mua i te tātaritanga ma te CD spectroscopy.Ko te matawai matawai o nga CD me te roangaru o te 185 ki te 260 nm i kohia i runga i te Jasco J-1500 spectropolarimeter ma te whakamahi i nga cuvettes quartz me te 1 mm te roa o te ara whatu (Helma) i te 25°C i te tere o te 50 nm/min.I whakatikahia te awhiowhio CD, ka neke atu i te 10 nga whiwhinga, ka huri ki te tikanga o te toenga ellipticity (θMRE) ki nga nekehanga cm2/dmol:
ko te MW te taumaha ngota o ia tauira i Da;N ko te maha o nga waikawa amino;Ko te θ te ellipticity i roto i nga manomano;d e hāngai ana ki te roa o te ara whatu i te cm;te kukū pūmua i ngā waeine.