310 10*1mm Waahanga matū ngongo ngongo kowiri tira, Ko nga rohe-N o te spidroin ka hanga hydrogels i runga i nga fibrils amyloid me te whakarato i tetahi papa mo te aukati i te pūmua.

Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Kei te whakamahi koe i tetahi putanga tirotiro me te tautoko CSS iti.Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tua atu, hei whakarite i te tautoko tonu, ka whakaatuhia e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Rēreti e whakaatu ana i nga tuhinga e toru mo ia kiriata.Whakamahia te patene o muri me te taha o muri hei nuku i roto i nga kiriata, ko nga paatene mana kiriata kei te pito ki te neke ma ia kiriata.

Whakatakotoranga

310 10*1mm He kowiri tira nga kaiwhakarato ngongo kapi

Hangahanga matū

Nga Taonga Miihini

He maha nga whakamahinga o nga pūmua hiraka pūngāwerewere whakahiato (te pūmua hiraka pungawerewere) i roto i te whanaketanga o nga mea koiora hou, engari ko te ahua maha me te whakahiato he uaua ki te tiki me te ngawari ki te whakamahi.I konei ka ripoatahia e matou ko nga pūmua spidroin iti whakahiato me te mea nui, ko te rohe-N-terminal (NT) ano ka tere te hanga i nga hydrogels tautoko-whaiaro me te maramara i te 37 °C.Ko nga pūmua whakakotahi he NT me te pūmua rewharewha kaakaariki, he purine nucleoside phosphorylase ranei te hanga i nga pūmua hanumi tino mahi.Waiwai.Ko o maatau hua e whakaatu ana ko te NT recombinant me nga pūmua hanumi e whakarato ana i nga hua korero teitei me te whakawhiwhi i nga hydrogels ki nga ahuatanga ataahua penei i te maramatanga, te whakahiato me te kore e honoa, me te aukati tika o nga pūmua hohe i te kiato teitei.
E whitu nga huinga hiraka rereke o nga pungawerewere, he momo hiraka motuhake o ia tangata.Ko nga momo hiraka e whitu he mea tito he pūmua hiraka pungawerewere (spidroins) tata ki te 6000 toenga te roa, kei roto he rohe tukurua nui i te pokapū e karapotia ana e nga rohe porowhita N- me C-terminal (NT me CT)1,2.Ko te momo hiraka e tino rangahauhia ana, ko te ampulla tuatahi, ka mahia e te repe ampulla tuatahi.I roto i tenei repe, he monolayer o nga pūtau epithelial e synthesizes spidroin proteins me te huna ki roto ki te lumen o te repe, kei reira i roto i te ahua whakarewa (doping) i nga kohinga teitei rawa (30-50% w / v)3,4.Kua tautohetia te whakaritenga me te hangai o nga pūmua spidroin ampullar matua i roto i te repe, engari ko te nuinga o nga taunakitanga whakamatautau e tohu ana i te ahua o te ahua o te helical me/ranei matapōkeretia me nga hanganga micellar or lamellar5,6,7,8,9,10.Ahakoa ko nga rohe tukurua e whakahaere ana i nga ahuatanga miihini o nga muka hiraka, te hanga i nga nanocrystals β-sheet me nga hanganga amorphous11,12,13,14,15, ko nga rohe mutunga ka whakahaere i nga muka hiraka hei whakautu ki nga ahuatanga rereke i te taha o te hiraka hiraka16,17,18.Ma te whakahaere i te hanga hiraka, 19. Ko nga rohe kapeka ka tiakina te tipu, ka noho noa te mahi ki nga pūmua spidrin katoa 2,20,21.I te wa e haere ana i roto i te repe, ka heke te pH o te spidroin mai i te 7.6 ki te <5.716 ka piki ake ma te kutikuti me te totoro ka takawaenga ma te neke haere i roto i te awa e iti haere ana.I roto i te otinga, ko te CT he α-helical constitutive parallel dimer17, engari hei whakautu ki te iti o te pH me te kaha kutikuti, ka tuwhera a CT ka huri i te β-layers16, 17, ka puta pea nga paparanga β i nga rohe tukurua o Convert 16. Ko te NT he monomeric i raro Ko nga ahuatanga e whakaatu ana i nga tikanga i roto i te lumen o te repe me te takawaenga i te whakarewatanga o te spidroin, engari i te iti o te pH, ko te protonation o te maha o nga mekameka taha waikawa carboxylic ka arahi ki te dimerization o te NT me te pKa o te 6.5, na reira ka whakapumau i te NT me te whakatika i te spidroin i roto i te rahi. rahinga.whatunga16,18.No reira, he mahi nui a NT ki te hanga kakawaea, ka huri mai i te monomer i roto i te paninga ki te dimer i roto i te muka23,24,25.Ko te NT ka noho tino wairewa me te helical i raro i nga ahuatanga katoa i akohia ki te ra16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, i whakatenatena i tona whanaketanga hei tapanga whakaniko i te whakarewatanga mo te hanga o nga pūmua heterologous.
Ko te pūmua hiraka pūngāwerewere whakakotahi, he kotahi te NT, kotahi te rohe tukurua poto, kotahi CT, me te tohu His6 (His-NT2RepCT) mo te purenga, he rite te wairewa i roto i te parepare wai rite te pūmua hiraka pungawerewere taketake me te whai i nga ahuatanga nui o te pungawerewere hiraka. .kapinga 25.31.Ko tana-NT2RepCT ka taea te miro ki nga muka tonu ma te whakamahi i te miihini koiora i roto i te peehi wairewa pH 8 ka tukuna ki roto i te kaukau wai pH 525,32,33,34,35.Ko te fermentation bioreactor o E. coli e whakaatu ana i tana-NT2RepCT me te maimoatanga i muri mai i muri mai ka puta mai he 14 g/L i muri i te purenga.Ko te nui o te hua, te wairewa teitei, me te whakautu tika o tana-NT2RepCT ki nga tikanga waikawa ka kiia katoa ki te NT23, 25, 34.
I konei ka ripoatahia te tere o te hanga o nga hydrogels marama mai i nga pūmua spidroin recombinant, tae atu ki te NT anake, ma te whakawhao i tetahi otinga pūmua i te 37 °C.Ma te whakamahi i te thioflavin T fluorescence (ThT), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) me te tuku electron microscopy (TEM), i kitea e matou ko te NT me te microspider pūmua ka huri i te hanganga ki roto i nga rau-β me nga fibrils-amyloid. i te wa e hanga ana nga ra.I tua atu, ko nga pūmua hanumi o te NT me te pūmua fluorescent matomato (GFP) me te purine nucleoside phosphorylase (PNP) ka hanga hydrogels me nga kongakonga whakakotahitanga tino mahi.Ko te whakaputanga korero teitei i roto i nga ope heterologous, me te hanga tere o nga hydrogels i raro i nga tikanga ahupūngao, ka whakatuwhera i te whai hua o te hanga hydrogels me nga mahi miihini.
Kaore i rite ki te nuinga o nga korero mo te recombinant spidroin proteins36, Ko tana-NT2RepCT he pumau i roto i te parepare Tris-HCl i te pH 8 ka taea te aro ki te 500 mg/mL me te kore ua25.Na reira, i miharo matou ki te kite he tere te hanga o tenei pūmua i te marama o te mata, he waiora tautoko-whaiaro i te wa e whakakorohia ana i te 37°C (Fig. 1b-d).Ko etahi atu rangahau i whakaatu ko tana-NT2RepCT te whakahekenga i puta i runga i te whanuitanga o nga kohinga pūmua (10-300 mg / mL) me te mea he rereke tenei kukū ki te wa whakahiato (Fig. 1c me te Tāpiri 1).Kia mohio ai he aha nga wahanga o tana-NT2RepCT hei takawaenga i te hanga hydrogel, katahi ka tirotirohia e matou ia rohe takitahi me nga momo whakakotahitanga ma te whakamahi i te whakamaarama whakahuri ipu (Whakaahua 1a,b).Ko nga hautau katoa i whakamatauria o te spidroin recombinant i hanga i nga ra (i te kukū pūmua o te 300 mg/mL) i roto i te iti iho i te 1 haora, engari mo te 2Rep kua heke (Fig. 1b).Ko te tohu tenei ko te NT me te CT anake, i te whakakotahi, i te hono ranei ki te tukurua, ka taea te peera i te 37°C me te tohu His6 kaore e pa ki tenei mahi ki tetahi waahanga nui.I runga i te whakaaro noa ko te NT he pūmua tino wairewa me te pūmau, a ko nga purongo o mua mo te recombinant spidroin hydrogels i kii i nga paanga o te weriweri ki nga whakarereketanga o nga rohe tukurua me nga CT / ranei, ka taea e NT ake.Ko te kitenga o te waiu he mea ohorere.Ripanga Tāpiri 1) 37, 38, 39. He mea whakamiharo, ko te NT kua pupuhi i roto i nga meneti 10 i te kukū o ≥ 300 mg / mL (Fig. 1c).Ko nga whakamatautau hurihuri o te ipu me nga momo whakamohoatanga o te NT i whakaatu i te >50 mg/mL te otinga NT he tere ake i tana-NT2RepCT i te kukū e rite ana (w/v, Whakaahua 1c).
Ko te ahua o te ahua o nga momo hanga spidroin i akohia i tenei mahi.b Te wa o te kaera i te 37 °C mo nga momo pūmua spidroin recombinant (300 mg/mL) i manatoko ma te huri i te ipu.CT gel i te wa tonu kaore he heki (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm tauine).c Waa kaera o tana-NT2RepCT me te NT i nga tohu o te pūmua i te 37°C.d Ko nga whakaahua o His-NT2RepCT me te NT hydrogels me te pungawerewere me te reta "NT" i taia ki raro, ia mea (200 mg/mL, pae tauine 5 mm).
He paku rereke nga tae o nga hauwai i hangaia e nga momo pūmua spidroin recombinant, me te kite kanohi tahanga e whakaatu ana i nga nekehanga rereke o te maramatanga (Fig. 1b).He tino maamaa nga gel NT engari ko etahi atu gel ka puataata.Ko tana-NT2RepCT me te NT nga kara ka maka ki roto i nga ngongo porotakaroa ka taea te tango mai i te pokepokea tonu (Fig. 1d).
Hei whakamatautau mena he whakakikorua hiraka o te pungawerewere maori i raro i nga tikanga kua kitea i naianei ka puta te whakakoi o nga pūmua spidroin recombinant, i kohia nga paninga mai i te repe ampulla nui o te pungawerewere piriti Huitene (Larinioides sclopetarius).Ko nga paninga i rongoa i roto i te 20 mM Tris-HCl buffer i te 50 mg / mL (i runga i te taumaha maroke kua inehia), engari kaore i kitea he whakakoi i roto i te 21 ra incubation i te 37 °C (Taupiri Whakaatu 2a).
Hei ine i enei ra, ka taea te whakamahi inenga rheological ki te ako i te tukanga whakahiato me te whakatau i nga ahuatanga miihini katoa.Ina koa, ko te aro turuki i te waahanga rokiroki (elasticity) i te teitei o te mahana ka taea te whakarato korero mo te pāmahana reera tae atu ki nga ahuatanga viscoelastic o te paninga.Ko nga whakamatautau mo te piki ake o te pāmahana (ma te whakamahi i te 1 ° C / min i te 25-45 ° C, i runga i nga rangahau o mua ma te whakamahi i nga rongoā hiraka taiao) 40,41 i whakaatu ko te waahanga rokiroki o His-NT2RepCT me nga otinga NT i piki ake me te piki ake o te pāmahana.i whakanuia (Whakaahua 2 me te Whakaaturanga Tāpiri 3).Ko te mea nui, i timata te tipu o te waahanga NT i te iti ake o te pāmahana i whakaritea ki tana-NT2RepCT, e rite ana ki te tere tere o te waa i kitea i te wa i whakakororiahia te NT ki tana-NT2RepCT i te 37 ° C (Whakaahua 1).Whai muri i te hekenga o te pāmahana, karekau te waahanga rokiroki i hoki ki nga uara iti, ka noho ki runga ake i te huringa mate (tirohia te Whakaaturanga Tāpiri 3), e tohu ana i te waiariki e kore e taea te huri.I muri i te whakawhanaungatanga, ko te waahanga elastic whakamutunga mai i te 15 ki te 330 kPa mo His-NT2RepCT hydrogels i te kukū o te 100-500 mg/mL, me te waahanga elastic whakamutunga mo te NT hydrogels (100-500 mg/mL) mai i te 2 ki te 1400 kPa (Fig. , 2 and complete ramp data) tirohia te Tāpiri 3.
a Hurihia te pāmahana i te inenga o tana-NT2RepCT (300 mg/mL) me te b NT (300 mg/mL) me te wiri.Ko nga pere e tohu ana i te ahua o te pāmahana, a ko te whakamarumaru o nga raraunga waahanga rokiroki e whakaatu ana i te whakamatautau i nga uara taipana iti ake mo te taputapu kaore i tohua e te kaiwhakanao, koinei te take o te haruru.c Whakamutunga-kōwae kohinga o tana-NT2RepCT me NT i muri i te teitei o te pāmahana (100, 300, me te 500 mg / mL).Ka mauhia nga panui kōwae katoa i te auau o te 0.1 Hz.
Hei tikanga pea mo te tirotiro i nga huringa whakangao e pa ana ki te whakawhanaungatanga, i tuhia e matou te FTIR spectrum o tana-NT2RepCT me te NT i mua i muri mai i te whakawhanaunga i te 37°C (Whakaahua 3a,b).I te mea e tumanakohia ana, ko te ahua o tana-NT2RepCT me nga otinga NT e rite ana ki nga pūmua e whakaatu ana i te hanganga tuarua α-helix / coil tupurangi, me te roopu whakahua i te 1645 cm-1.Mo nga hydrogels e rua, ka puta mai i te wa e rua nga ringa i roto i te ropu I waenganui i te 1617 cm-1 me te 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), e tohu ana i te hanganga o nga hanganga β-sheet antiparallel.Ka kitea ano enei huringa i roto i te waahanga tuarua o te waahanga me te rerekeetanga o te hiihini (Taapiri Fig. 4b).Ko nga roopu e rua o te NT β-layer he nui ake te korero atu i o His-NT2RepCT, e tohu ana ko te katoa o nga ihirangi o nga roopu β-layer i roto i te NT hydrogel he teitei ake i te NT2RepCT hydrogel.
he FTIR absorption spectra of His-NT2RepCT and b NT (e rua 500 mg/mL) i mua i te (whakarewa) me muri i te (gel) incubation i te 37°C.c nga whakaahua TEM o te 50 mg/ml NT2RepCT gel me te d NT.Pae tauine 200 nm.e Nga diameter muka o tana-NT2RepCT me te NT hydrogels.n = 100 nga muka ine, p <0.0001.Ko nga pae hapa e whakaatu ana i te rereke paerewa.Ko te pokapū o nga pae hapa ko te tikanga.I whakamahia he whakamatautau-t kore takirua (rua-hiku) mo te tātari tauanga.f ThT korikori o nga momo pūmua spidroin recombinant (100 mg/mL) i te 37 °C me te kore e wiri.g NT (100 mg/mL) nga whakamatautau werohanga mai i te 100 mg/mL NT gel me te 0%, 5%, 10%, me te 20% nga kakano.
Ko te tātaritanga o te kaera ma te whakamahi i te miihini irahiko tuku (TEM) i whakaatu ko te hydrogel kei roto i nga fibrils-amyloid (Figs. 3c, 3d).Ko nga fibrils i hangaia e NT he roa (5-12 nm te whanui) me te kore manga, i te mea he poto ake te roa o nga fibrils His-NT2RepCT me te tino whanui te whanui (7-16 nm) (Fig. 3e).Ko enei hua ka taea e matou te whai i nga kinetics o te fibrosis ma te whakamahi i te thioflavin T (ThT) assay.Mo nga pūmua spidroin recombinant katoa, ka piki ake te tohu rewharewha i te wa i whakamohoatia ai nga tauira ki te 37 °C (Fig. 3f, Tāpiritanga Fig. 5a).I runga ano i tenei kitenga, ko te tirotiro moroiti o NT me tana-NT2RepCT i raro i nga tikanga whakaraerae ka kitea te pikinga o te ThT fluorescence me te kore e kitea te whakaemi a rohe o nga whakahiato ThT-positive (Taupiri Fig. 5b,c).Ko te hanganga o te ThT-positive fibrils kaore i haere tahi me te piki ake o te NT me tana-NTCT turbidity (Taupiri Fig. 5d), ko te tikanga ka taea e te whatunga o nga fibrils i roto i te kaera te hanga me te kore e whakaiti i te marama o te kiri.Ko te rui ma te taapiri i te iti o nga fibrils i hangaia i mua ka taea te whakatere i te hanga fibril o etahi amyloids42,43,44 engari te taapiri i te 5%, 10%, 20% ranei (w/w) NT ki te otinga o te NT hydrocoagulants.pānga purapura (Fig. 3g).Ko tenei pea na te mea ko nga fibrils kei roto i te hydrogel he mea pumau, kaore e taea te whakamahi hei kakano.
Ko te whanonga ohorere o nga pūmua spidroin recombinant i te teitei o te pāmahana i akiakihia etahi atu rangahau mo te resonance autō karihi (NMR) ki te tautuhi i nga huringa hangai e pa ana ki te hanga ra.NMR spectra of His-NT2RepCT solutions recorded over time at 37°C show that CT was still folded part, while NT and 2Rep signals have disappeared (Fig. 4a), fokotu'u e ko te nuinga o NT me 2Rep te wahanga whakahaere o te hanganga o His- NT2RepCT hydrogel.I whakahekehia ano te tohu CT ki te 20% o tona kaha taketake, e kii ana ko te CT te nuinga o te waa kua whakaritea me te whakauru ki roto i te hanganga hydrogel.Mo te waahanga iti ake o te CT, he rite tonu ki te pūkoro pera i te tauira kua whakauruhia, ka kitea e te otinga NMR, karekau he tohu tohu mo nga toenga hanganga 10 tuatahi, na te uaua o te aukati i te waahanga piri o tana-NT2Rep.Ko te ahua o te NMR o te -state of hydrogels -NT2RepCT i whakaatu i te nuinga o te waahi o te α-helices me te β-layers, a, ki te iti ake, ko te ahua o te coil matapōkere (Fig. 4b).Ko te tātari huringa matū o nga toenga methionine kei roto anake i te NT i whakaatu kua hurihia tenei rohe ki te hanganga rau-β.Ko te waahi-waa o te NT i roto i te otinga i whakaatu i te hekenga o te kaha o te tohu (Fig. 4c), me te NMR o te NT hydrogels i whakaatu ko te nuinga o nga toenga NT i hurihia ki nga hanganga β-sheet (Fig. 4d).Ko te ahua o te 2Rep kaore i taea te whakatau motuhake na te kaha ki te whakahiato.Engari, he tino rite te ahua o te ahua NMR spectra o te NTCT me His-NT2RepCT hydrogels (Fig. 4b; Tāpiritanga Fig. 6b), e kii ana he iti te takoha a 2Rep ki te waahanga hanganga o te His-NT2RepCT hydrogel.Mo te CT hydrogels, α-helices, β-sheets, me nga hanganga tuarua helical matapōkere i kitea kei te noho tonu (Taupiri Fig. 6d).E tohu ana tenei ko etahi waahanga o te CT ka noho hei α-helices ko etahi ka waiho hei β-pepa.No reira, ko nga hua o te tirohanga a NMR e kii ana he mea nui te NT mo te hanga hydrogel me te huri ano ki te hangahanga β-pepa i runga i te whakakotahitanga me te 2Rep me te CT.I runga ano i tenei, i kitea tata nei ka puta mai nga kutumu mokowā amyloid i roto i nga topa e rima o te rohe NT, a ko te Waltz algorithm i tohu he rohe amyloidogenic i te helix 1 (Fig. 4e).
2D spectra of 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT solution i mua i te (puru) me te 19 haora i muri i te incubation (whero) i te 37°C.Ko nga tihi ripeka takitahi i roto i te tuāwhiorangi whero me te F24, G136, polyA i te hihinga kikorangi e tohuhia ana e nga tohu waikawa amino reta kotahi me nga tau toenga.Ko nga whakaurunga e whakaatu ana i te ti'aturi o te kaha tohu i te wa mo nga toenga kua tohua mai i nga rohe NT, 2Rep, me CT.b Te reo irirangi irirangi-kore (RFDR) o nga hiko wai-NT2RepCT.Ko nga hononga o nga toenga Cα/Cβ i kitea i roto i te RFDR spectra i whakatauhia ma te whakataurite ki nga tauira peptide matū nekehanga me nga uara i ahu mai i nga tatauranga82,83 me o raatau hanganga tuarua.SSB – takahuri taha taha.c Ko te ahua kotahi o te 15N-HSQC 10 mg/mL otinga NT i te wa e whakakororia ana i te 37 °C mo te 36 haora.Ko te whakaurunga e whakaatu ana i te kaha rōrahi me te wa.d Te ahua totoka RFDR hihinga o NT hydrogels.Ko nga hononga o nga toenga Cα / Cβ me o raatau hanganga tuarua e kitea ana i roto i te RFDR spectra e tohuhia ana.e I runga i te NT45.79 fibrillation propensity profile from the Zipper database (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Ko te kaha o Rosetta o te matapihi hurihanga uira mokowhiti o te hexapeptide ka whakaatuhia ki te kcal/mol.Ko nga kaho whero e tohu ana i nga hexapeptides me te kaha o te fibrosis teitei (te kaha Rosetta kei raro iho -23 kcal/mol; kei raro i te raina iraira).Ko nga kao kaakaariki e tohu ana i nga kongakonga me te kaha o Rosetta kei runga ake i te paepae, na reira ka iti ake te ahua o nga kumemau steric.Ko nga kongakonga kei roto proline i kapea mai i te tātaritanga (kaore he pou).Ko nga tapawha e tohu ana i nga waahi o te amyloidosis i tohuhia e te Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org).Ko te raupapa o nga toenga waikawa amino o te NT kei runga ake, a ko nga momo toenga e kitea ana i roto i te hanganga tuarua β (kua whakatauhia e te ahua totika NMR spectroscopy) ka whakaatuhia ki te whero.Ko nga waahi o nga NT α-helices e rima kua tohua hei (H1-H5)28.
I te pH <6.5, ka tarekare te HT, he ātete ki te wera, te urea ranei te denaturation18.Hei whakamaarama he pehea te paheketanga o te dimerization me te pumau o te NT, ko nga rongoatanga kei roto te 100 mg/ml NT i whakahaeretia i te pH 8, 7, me te 6 ma te whakamahi i te whakamatautau hurihuri vial.Ko nga tauira NT i whakakororiahia i te pH 8 me te 7 ka whakaahuruhia i muri i te 30 min i te 37 °C, engari ka noho marama tonu te pH 8 gel, i te wa e whakaatu ana te pH 7 gel i te rerenga kitea (Fig. 5a).He rereke, ko te otinga kei roto i te HT i te pH 6 kaore i hanga he reera, ka kitea he rerenga nui i muri i te 20 meneti i te 37°C.Ko te tohu tenei ko nga dimer ake me / ranei to ratou pumau teitei ake ki te whakatairite ki nga monomers hei aukati i te whakawhanaunga.Ko te hanga o te waipara mo te NT i te pH 7 me te 6 kaore i whakaarohia, na te mea kua kii mai he wairewa te NT i te 200 mg/ml27, ka ngawari te whakahoki i muri i te whakahekenga o te wera, me te pupuri ano i te α-helix i nga uara iti o te pH 18. Ko te whakamaramatanga pea mo enei rereketanga ko nga whakamatautau i korerotia i mua i mahia i te pāmahana rūma, i raro ranei, i te iti ranei o te kuhanga pūmua16,18,19.
Whakamātautau kōaro kōaro NT (100 mg/mL) i te pH 8, 7, 6 me te 154 mM NaCl (pH 8) i muri i te hekitanga i te 37°C.b NT CD tūāwhiorangi me te kore 154 mM NaF me te 154 mM NaCl, ia.Ko te ellipticity molar i te 222 nm ka huri ki te wahanga o nga kopa taiao.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT* (37 °C me 60 °C), NTA72R (37 °C), me tana-NT-L6 (37 °C me 60 °C).d CD spectra of NT mutants NT*, NTA72R, and His-NT-L6.Ko te ellipticity molar i te 222 nm ka huri ki te wahanga o nga kopa taiao.e Whakamātautau hurihanga o NTFlSp, NTMiSp me te NTMiSp whakaheke (100 mg/mL).Pae tauine 5 mm.f CD tūāwhiorangi o NT, NTFlSp, NTMiSp me NTMiSp whakaiti.Ko te ellipticity molar i te 222 nm ka huri ki te wahanga o nga kopa taiao.Katoa nga momo NT i te 25 °C me te 95 °C kei te Whakaaturanga 8.
Ko te kukū o te tote tinana e whakatau ana i nga taunekeneke hiko i waenga i nga waahanga iti o te NT me te dimerization o te whakawhiti NT ki te pH18 raro.I kitea e matou ko te aroaro o te 154 mM NaCl me te NaF i tino aukati i te whakawhanaunga (Fig. 5a, b; Fig. 2b taapiri) a na enei tote i whakanui ake i te pumau o te waiariki o nga monomers NT (Fig. 5b, Whakaaturanga 8). .E kii ana hoki ko te whakakaha ake i te whakapumautanga, kaua ko te dimerization, ka aukati i te hanga gel.
Hei tuhura ake i te mahi o te dimerization pūmua me te whakapumautanga i roto i te whakawhanaunga, i whakamahia e matou e rua nga mutants, NT* me NTA72R, he monomeric ano i te pH28.30 iti.Ko te NT* he mutant whakamuri utu rua e whakapapahia ai te tohatoha utu dipolar o te monomer, e aukati ana i te dimerization me te tino whakanui ake i te pumau o te monomer.Ko te NTA72R he dipole kua utaina, engari ko Ala kua whakakapihia e Arg kei te rohe dimer, na reira ka whakararu nga whakawhitinga i nga tauwhitinga waahanga iti e hiahiatia ana mo te whakamaarama.I runga i te incubation i te 37 ° C, kaore a NT * i hanga i te hydrogel, i te wa i hangaia e NTA72R he kiri opaque mo te 15 min (Fig. 5c).I te mea e kore e taea e te NT* me te NTA72R te whakamarumaru engari he rereke i te pumau o te monomer (Fig. 5d), e tino tohu ana enei hua ko te kaha o te whakamaarama werawera e aukati ana i te NT mai i te weranga.Ka tautokohia ano tenei e te meka ka hangaia e te HT * he reera i te wa e kore e mau i te pāmahana teitei (i muri i te 8 min i te 60 ° C; Fig. 5c).Kua whakaatuhia i mua ko te nui o te methionine i roto i te NT ka whakawiri i tana kopaki maori, a e ono nga whakakapi Met ki Leu (e kiia ana i konei ko tana-NT-L6) ka tino whakapumau i te monomer NT46.I runga i te whakaaro e hiahiatia ana te ngawari o te hanganga mo te hanga NT gel, i kitea e matou ko te Mutant stable His-NT-L6 kaore i te 37 °C (Whakaahua 5c, d).Engari, i hanga ano e tana-NT-L6 he reera i runga i te incubation i te 60 ° C mo te 60 min (Fig. 5c).
Ko te kaha o te NT ki te huri ki roto i nga hanganga β-pepa me te hanga hydrogels te ahua e pa ana ki etahi engari ehara i te katoa o nga rohe NT o te spidroin.Ko nga NT mai i nga momo hiraka rereke me nga momo pungawerewere, Trichonephila clavipes (NTFlSp), i hanga he ra ahakoa te iti o te methionine me te teitei o te waiariki (Fig. 5e, f me te Ripanga Tāpiri 2).Engari, ko te NT mai i te spidroin pūmua ampullar iti mai i Araneus ventricosus (NTMiSp) me te iti o te waiariki me te ihirangi methionine teitei kaore i hanga hydrogels (Taupiri 2 me te Fig. 5e, f).Ko te mea whakamutunga ka hono pea ki te aroaro o nga hononga disulfide intramolecular29,47.I nga wa katoa, i te whakahekenga o nga here disulfide o NTMiSp, ka hangaia he hydrogel i muri i te incubation i te 37 ° C mo te 10 min (Fig. 5e).I te mutunga, me tohu ko te ngawari o te hanganga he mea nui, engari ehara i te mea anake, te paearu mo te hanganga o te gel mai i te NT.Ko tetahi atu take e tika ana ko te kaha ki te hanga fibrils amyloid, me te tātaritanga me te putunga raraunga kumemau me te Waltz algorithm i whakaatu he hononga i waenga i te kaha ki te hanga i nga ra me te noho mai o nga rohe amyloidogenic, tae atu ki te whānuitanga o nga rohe i tohuhia. ki te hanga kutumau steric.I puta he hononga (Ripanga Tāpiri 2 me te Whakaaturanga 9).
Ko te kaha o te NT ki te hanga fibrils me te hanga ra i raro i nga ahuatanga pai i kii ai matou ko te whakakotahitanga o te NT me etahi atu kongakonga pūmua ka taea tonu te hanga i nga ra me te mahi katoa o nga hoa whakakotahi.Hei whakamatautau i tenei, i whakaurua e matou te pūmua kowhai matomato (GFP) me te purine nucleoside phosphorylase (PNP) i te C-terminus o te NT, ia.Ko nga pūmua whakakotahitanga i puta mai i roto i te E. coli me nga hua whakamutunga tino nui (150 mg/L me te 256 mg/L nga ahurea ruru ruri mo tana-NT-GFP me tana-NT-PNP), e rite ana ki nga mea kua whakaatuhia. mo Ētahi atu pūmua kua hono ki te NT Ref.30. Ko tana-NT-GFP (300mg/mL) me tana-NT-PNP (100mg/mL) nga pūmua whakakotahi i hanga he ra i muri i te 2 haora me te 6.5 haora i te 37°C, a, ko te mea nui, ka noho tonu te hautanga GFP.ka kitea i muri i te whakawhanaunga, me te > 70% o te kaha o te rewharewha tuatahi e toe ana i muri i te whakawhanaunga (Fig. 6a).Ki te ine i te mahi PNP i roto i ana otinga-NT-PNP me nga ra, me waimeha matou i te pūmua hanumi ki te NT na te mea ko te mahi enzymatic o te whakarite parakore kei waho atu i te awhe rapunga o te whakamatautau i nga kuhanga reera.Ko te gel i hangaia me te ranunga kei roto 0.01 mg / mL His-NT-PNP me te 100 mg / mL NT i pupuri i te 65% o te mahi enzymatic tuatahi o nga tauira preincubated (Fig. 6b).I mau tonu te ra i te wa o te inenga (Taupiri Fig. 10).
he kaha o te karekorero i mua i muri mai i muri i te whakawhanaungatanga o tana-NT-GFP (300 mg/mL) me te ipu takahuri kei roto tona-NT-GFP hydrogel (300 mg/mL) i raro i te rama kitea me te UV.Ko nga tohu e whakaatu ana i nga inenga takitahi (n = 3), ko nga pae hapa e whakaatu ana i te ine paerewa.Ka whakaatuhia te uara toharite ki waenganui o nga pae hapa.b Ko te mahi PNP i whiwhihia ma te tātari fluorometric ma te whakamahi i nga rongoa me nga kaera kei roto i te NT (100 mg/ml) me te ranunga kei roto 0.01 mg/ml tana-NT-PNP me te 100 mg/ml New Taiwan tara.Ko te whakaurunga e whakaatu ana i tetahi ipu hurihuri kei roto he hydrogel kei roto tana-NT-PNP (5 mm pae tauine).
I konei, ka whakaatuhia e matou te hanganga o nga hydrogels mai i te NT me etahi atu pūmua spidroin recombinant na roto i te whakauru i te otinga pūmua i te 37°C (Whakaahua 1).Ka whakaatuhia e matou ko te whakawhanaungatanga e hono ana ki te hurihanga o nga α-helices ki nga paparanga β me te hanganga o nga fibrils rite-amyloid (Fig. 3 me 4).He mea miharo tenei kitenga na te mea he paihere porotaka rima-helix nga NT e mohiotia ana mo to ratou tino wairewa teitei me te tino pumau i te kuhanga >200 mg/mL i te 4°C mo etahi ra27.I tua atu, ka huri noa nga NT i muri i te paheketanga o te wera me te iti o te kukū pūmua i roto i te µM.E ai ki o maatau hua, ko te hanga fibril e hiahia ana ki te whakakotahi i te > 10 mg/mL te kukū pūmua me te pāmahana paku teitei (Fig. 1).E rite ana tenei ki te whakaaro ka taea te hanga mai o nga kaka amyloid mai i nga pūmua takai-a-poo kei roto i te ahua o te wea o te waiariki i raro i nga ahuatanga whaiaroaro 48 .Ko nga tauira o nga pūmua ka pa ki tenei huringa ko te insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin me te lysozyme51,52,53.Ahakoa he α-helix te NT i tona ahuatanga taketake, tata ki te 65% ​​o te mekameka polypeptide he hototahi ki te hanga kumemau steric (Fig. 4e) 45 .I te mea ko te monomer he mokowhiti kaha46, ka taea e ia te whakaatu i enei rohe amyloidogenic pea i nga pāmahana tino teitei, me te nui o te nui o te pūmua ka tae ki te kukū nui mo te hanga fibril amyloid54.I muri mai i tenei whakaaro, i kitea e matou he hononga kino i waenga i te kukū o te spidroin me te wa gellation (Fig. 1c), a ki te whakapumauhia te ahua o te NT monomeric ma te whakarereke (NT*, His-NT-L6) ma te taapiri tote ranei, ka taea te aukati i te hanga hydrogels (Fig. 5).
I roto i te nuinga o nga wa, ka ngaro nga muka amyloid mai i te otinga hei rerenga, engari i raro i etahi ahuatanga ka taea te hanga hydrogels55,56,57.Ko nga fibrils hanga hydrogel he nui te ahua o te owehenga me te hanga i nga whatunga ahu-toru pumau na roto i te whakawhanaungatanga ngota,55,58 e rite ana ki o maatau hua.Mo te hanga hydrogel in vitro, he maha nga wa ka horahia nga pūmua, hei tauira, ma te rongo ki nga whakarewa pararopi, te pāmahana teitei (70–90°C) me te pH iti (1.5–3.0)59,60,61,62/ranei.Ko nga hydrogels spidroin e whakaahuatia ana i konei kaore e hiahiatia he tukatuka pakeke, kaore ano hoki e hiahia ki nga kaihoko honohono-whiti hei whakapumau i nga hydrogels.
Kua puta te korero i mua ko te spidroin e tukurua ana me nga QD, ka puta he huringa β-pepa i te wa e huri hiraka ana, ka hanga hydrogels.Ka whakatauritea ki o maatau kitenga, he roa ake, he teitei ake ranei nga wa incubation me/ranei te mahana o te incubation, a ko nga hydrogels i puta mai he puatakore (Whakaahua 7 me te Ripanga Tāpiri 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. I tua atu i nga wa tere tere, ko nga NT hydrogels> 300 mg/mL (30%) i pai ake i era atu katoa e whakaahuatia ana te recombinant spider silk protein hydrogels, me nga hydrogels taiao penei i te gelatin, alginate (2%), agar (0.5 % ) me te collagen.(0.6%) (Whakaahua 7 me nga Ripanga Tāpiri 1 me 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
I whakatauritehia te wa o te reera me te huringa elastic o nga hydrogels i roto i tenei rangahau ki etahi atu hydrogels-a-spidroin me nga hydrogels maori kua tohua.Ka hoatu nga tohutoro me te whakamaarama mo nga ahuatanga o te waiu.APS Ammonium persulfate, te pāmahana rūma.Raraunga 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Te ahua nei kua whakawhanakehia e nga pungawerewere nga huarahi hei aukati i te tipu o te spidrin i te wa e rokiroki ana.Ahakoa te nui o te kukū o te pūmua i roto i te repe hiraka, ko te rohe tukurua nui e hono ana ki te rohe kāpeka ko te ahua o te kukū o te NT me te CT i roto i te repe e rite ana ki te 10-20 mg/ml, kei te rohe o tenei rangahau.e hiahiatia ana mo te hanganga hydrogel i roto i vitro.I tua atu, he rite nga kuhanga o nga tai 16 i whakapumau i te NT, pera i nga repe hiraka (Fig. 5b).Kua rangahauhia te ahua o te NT i roto i te E. coli cytosol ka kitea he pai ake te takai i te wa i tirohia i roto i te vitro, e tohu ana ko te tote me etahi atu mea ka aukati i te whakahiato i roto i te vivo.Engari, he mea nui pea te kaha o nga NT ki te huri ki roto i nga whaera β-sheet mo te hanga kakawaea me te tirotirohia mo nga rangahau a muri ake nei.
I tua atu i nga ahuatanga hou o te NT-amyloid-like fibril me te hanga hydrogel i kitea i roto i tenei rangahau, ka whakaatu ano hoki matou ko tenei ahuatanga he tono hangarau koiora me te rongoa koiora (Fig. 8).Hei tohu o te ariā, i honoa e matou te NT me te GFP me te PNP me te whakaatu ko te pūmua hanumi ka hanga hydrogels i te wa e whakakorohia ana ki te 37 °C me te nuinga o nga hautau GFP me te PNP e mau tonu ana a raatau mahi i muri i te whakaahuru (Whakaahua 6).Ko nga phosphorylase Nucleoside he whakakorikori nui te whakahiatotanga o nga analogues nucleoside75, e whai take ai ta tatou kitenga mo te umanga rongoa koiora.Ko te ariā o te whakaputa i nga pūmua hanumi e hanga ana i nga hydrogels maramara i raro i nga tikanga pai ka taea te hanga i nga hydrogels whai hua me nga taonga pai mo te whānuitanga o nga tono penei i te aukati i te whana, te tuku raau taero me te miihini kiko.I tua atu, ko te NT me te NT* he tohu tohu tino pai30, ko te tikanga ka taea te whakamahi i te NT me ona momo rereke mo te whakangao teitei o nga pūmua hanumi wairewa me te hanga i muri mai o nga pūmua whainga kore i nekehia i roto i nga hydrogels 3D.
Ko te NT he wairewa, he α-helic me te pumau i te iti o te kukū (µM) me te 37°C.I te rite tonu te pāmahana, engari i te piki haere o te kukū (>10 mg/ml), ka hangaia e te NT he raera kei roto i nga fibrils rite-amyloid.Ko nga pūmua whakakotahitanga NT ka hanga i nga ra o te fibrillar me nga kongakonga whakakotahitanga tino mahi, ka taea te whakakorikori i nga momo pūmua i roto i nga hydrogels 3D ma te whakamahi i te NT.Raro: NT (PDB: 4FBS) me nga whakaahua o nga kupenga muka me nga hanganga pūmua e hono ana (ka whakaarohia, kaore i tohia ki te tauine, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Ko nga hangahanga (tirohia te Ripanga 4 mo te rarangi katoa tae atu ki nga raupapa waikawa amino) i katihia ki te plasmid pT7 ka huri hei E. coli BL21 (DE3).Ko te E. coli kei roto i nga plasmids kua hangaia, ka werohia ki roto i te hupa Luria kua taapirihia ki te kanamycin (70 mg/l) ka whakatipuria i te po i te 30°C me te 250 rpm.Ka werohia te ahurea ki te 1/100 ki roto i te reo LB kei roto kanamycin me te whakatipu i te 30°C me te 110 rpm kia eke te OD600 ki te 0.8.Mo nga rangahau NMR, i tipuhia nga huakita i roto i te reo M9 iti rawa kei roto te 2 g o te D-glucose 13C (Aldrich) me te 1 g o te haukinia chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) mo te tapanga pūmua me nga momo momo.Whakahekea te pāmahana ki te 20 nga nekehanga Celsius me te whakakorikori i te whakaaturanga pūmua me te 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (te kukū whakamutunga).I muri i te whakaaturanga pūmua i te po, ka hauhake nga pūtau i te 7278×g, 4°C mo te 20 min.I whakatārewahia nga pire pūtau ki te 20 mM Tris-HCl, pH 8, ka whakatotoka kia whakamahia ano.I lysedhia nga pūtau kua rewa ma te whakamahi i te whakakorikori pūtau (nga miihini raupapa TS, Constant Systems Limited, Ingarangi) i te 30 kPa.I muri iho, ka werohia nga lysates i te 25,000 g mo te 30 meneti i te 4°C.Mo te NTMiSp, ka tukuna ano te pire i roto i te 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ka sonicated mo te 2 min (2 s on/off, 65%), ka centrifuged ano i te 25,000 xg, 4° C. i roto. 30 min.I utaina te supernatant ki runga i te pou Ni-NTA, ka horoia ki te 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, a ka mutu ka tukuna te pūmua ki te 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Hei whakaputa NT2RepCT me NTCT, thrombin digestion te whakauru i te pae (ThrCleav) i waenga i Tona me NT.Kei roto ano hoki nga waahi pakaru o Thrombin i tana-NT-ThrCleav-2Rep (whakaputa i te 2Rep), tana-thioredoxin-ThrCleav-NT (whakaputa NT), tana-thioredoxin-ThrCleav-CT (whakaputa CT), tana-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (whakaputa NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (whakaputa NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (whakaputa NTF1Sp), me tana-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (whakaputa NTMiSp).Ko nga hanganga i kerihia ki te thrombin (1: 1000) me te taraihia i te po i te 4 ° C. me te 20 mM Tris-HCl, pH 8, ma te whakamahi i te membrane dialysis Spectra / Por me te paepae taimaha o te 6-8 kDa.Whai muri i te whakaheke toto, ka utaina te wairewa ki runga i te pou Ni-NTA ka kohia te waipara kei roto te pūmua o te huanga.I whakatauhia nga kohinga pūmua ma te ine i te urunga o UV i te 280 nm ma te whakamahi i te whakarea mate o ia pūmua, hāunga te NTF1Sp, i whakamahia te whakamātautau Bradford e ai ki te kawa o te kaihanga.I whakatauhia te parakore e te SDS polyacrylamide (4–20%) gel electrophoresis me te Coomassie kanapa puru puru.I kukū nga pūmua ma te whakamahi i nga whiriwhiringa centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) i te 4000 xg me te 10 kDa molecular weight cutoff i roto i nga huringa 20 meneti.
Whakawerahia te wairewa pūmua, ka ata paipatia te 150 µl ki roto i te 1 ml ipu septum marama (8 x 40 mm Thermo Scientific).Ka kapi nga ngongo me te hiri ki te parakiriata kia kore ai e mimiti.Ko nga tauira (n = 3) i whakakororia i te 37°C, 60°C ranei, ka huri i ia wa ki te kite i te wairewa.Ko nga tauira karekau he ra ka whakamomorihia mo te kotahi wiki neke atu.Whakaitihia nga here disulfide NTMiSp me te 10 mM DTT mo ia 10 µM pūmua.Hei tātari i te whakahiatotanga o nga paninga hiraka pungawerewere maori, ka tapahia te pungawerewere piriti Huitene, ka tukuna nga repe nui e rua ki roto i te 200 μl o te 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 ka tapahia kia wehea te paninga mai i nga repe..Ko nga mea o roto o nga repe ka rewa ki roto i te parai, 50 µl mo te whakatau i te taumaha maroke (ma te heki o nga ipu tuwhera i te 60 °C ki te taumaha tonu) me te 150 µl mo te whakakoi i te 37 °C.
Ko te hangahanga / taputapu ine he kowiri tira ma te whakamahi i te pereti whakarara me te diameter o runga o te 20 mm me te aputa o te 0.5 mm.Whakawerahia te tauira mai i te 25 °C ki te 45 °C ka hoki ki te 25 °C i te tere o te 1 °C ia meneti ma te whakamahi i te pereti Peltier raro kowiri tira.I mahia inenga wiri i te auau o 0.1 Hz me te rohe viscoelastic rārangi o te rauemi i te riaka o 5% me te 0.5% mo nga tauira o 100 mg/mL me 300-500 mg/mL, ia.Whakamahia he rūma haumākū ritenga hei aukati i te whakaetonga.I tātarihia nga raraunga ma te whakamahi i te Prism 9.
Mo te kohikohi i te tuwhatanga infrared (IR) i te pāmahana rūma mai i te 800 ki te 3900 cm–1.Ko te taputapu ATR, me te ara marama i roto i te spectrometer, ka purea ki te hau tātari maroke i mua i te wa o te whakamatautau.Ko nga otinga (500 mg/mL ki te whakaiti i nga tihi o te whakauru wai i roto i te hihinga) i paipahia ki runga i nga tioata, ka hangaia nga ra (500 mg / mL) i mua i te ine, ka whakawhitia ki nga tioata (n = 3).1000 matawai i tuhia me te taumira o te 2 cm-1 me te kore o te huringa mahi o te 2. Ko te pärönaki tuarua i tatauhia ma te whakamahi i te OPUS (Bruker) ma te whakamahi i te awhe whakaene o nga tohu e iwa.I whakatauritehia te awhiowhio ki te rohe whakauru kotahi i waenga i te 1720 me te 1580 cm-1 ma te whakamahi i te F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.I roto i te ATR-IR spectroscopy, ko te hohonutanga o te kurupae o te kurupae infrared ki roto i te tauira ka whakawhirinaki ki te tau ngaru, ka kaha ake te whakaurunga ki nga tau ngaru iti ake i nga tau ngaru teitei.Ko enei paanga kaore ano kia whakatikahia mo te hiranga e whakaatuhia ana i te Fig.3 na te mea he iti rawa (Taapiri Fig. 4).I tatauhia te tuwha kua whakatikahia mo tenei ahua ma te whakamahi i te rorohiko Bruker OPUS.
Ko te tikanga, ka taea te inenga matawhānui o te whakahiato pūmua i muri i te whakahekenga pono o nga waahanga kei roto i te tihi amide I.Heoi ano, ka ara ake etahi arai i roto i nga mahi.Ka puta te haruru i roto i te tuāwhiorangi hei tihi (teka) i te wa o te whakakorenga.I tua atu, ko te tihi na te piko o te wai e rite ana ki te waahi o te amide I peak, a he rite te nui o te rahi mo nga tauira kei roto te nui o te wai, penei i te aqueous gel i akohia i konei.No reira, kaore matou i ngana ki te whakapohehe i te tihi o te amide I, a me whakaaro noa a maatau tirohanga hei tautoko i etahi atu tikanga penei i te NMR spectroscopy.
Ko nga otinga o te 50 mg/ml NT me tana-NT2RepCT i whakaraerahia i te po i te 37°C.Katahi ka waimehahia te hydrogel ki te 20 mM Tris-HCl (pH 8) ki te kukū o te 12.5 mg/ml, ka ruia pai, ka paipatia kia pakaru te ra.I muri iho, 10 nga wa i waimehahia te hydrogel ki te 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl o te tauira ka tukuna ki te matiti parahi kua pania ki te formvar, ka tangohia te tauira i te taikaha ki te pepa blotting.I horoia nga tauira ki te 5 µl o te wai MilliQ, ka pania ki te 1% uranyl formate mo te 5 meneti.Tango i te poke i te taikaha ki te pepa ngongo, ka whakamaroke hau te mata.I mahia te whakaahua ki enei matiti ma te whakamahi i te FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN e mahi ana i te 100 kV.I tuhia nga whakaahua ki te x 26,500 me te x 43,000 te whakanui ma te whakamahi i te kamera Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany).Mo ia tauira (n = 1), 10-15 nga whakaahua i tuhia.I whakamahia te ImageJ (https://imagej.nih.gov/) mo te tātari whakaahua me te ine i nga diameter muka (n = 100, he rereke nga muka).I whakamahia te Prism 9 ki te mahi i nga whakamatautau-t kore takirua (rua-hiku).Ko te tikanga o His-NT2RepCT me NT fibrils ko 11.43 (SD 2.035) me te 7.67 (SD 1.389) nm, ia.Ko te waahi whakawhirinaki (95%) ko -4.246 ki -3.275.nga nekehanga o te herekore = 198, p <0.0001.
80 µl o nga tauira wai kei roto 10 µM thioflavin T (ThT) i inehia i roto i te taarua (n = 3) i raro i nga tikanga pateko ma te whakamahi i nga pereti raro maamaa o raro o Corning 96-poka (Corning Glass 3881, USA).I tuhia nga rereketanga o te rererangi ma te whakamahi i te 440 nm excitation filter me te 480 nm emission filter (FLUOStar Galaxy mai i BMG Labtech, Offenburg, Germany).Ko te tohu ThT karekau i kukū, karekau ranei i tineia, i te mea i mahia nga whakamatautau me nga kuhanga rereke o te ThT me te kore e whakarereke i te kaha o te tohu.Tuhia te urunga ki te 360 ​​nm mo te ine kohu.Mo nga whakamatautau ruinga, 100 mg/mL nga kara i hangaia i te 37° C., ka whakamauhia, ka whakamahia mo te rui i nga molar ratio o 5%, 10%, me te 20%.I tātarihia nga raraunga ma te whakamahi i te Prism 9.
Whakawerahia nga rakau o His-NT2RepCT me te NT>100 mg/mL ki runga tio ka tātari ma te tātari 0.22 µm.I tatauhia nga kohinga ma te ine i te mimiti i te 280 nm ma te whakamahi i te Nanodrop.I roto i nga puna o te pereti 96-poka pango pango kore here (Corning) me te marama o raro, ka diluted nga tauira ki te 20 mg/ml i roto i te 20 mM Tris-HCl pH 8 ka konatunatua ki te 5 μM ThT (whakamutunga whakamutunga), te kohinga tauira katoa. 50 μl rōrahi.I whakaahuahia nga tauira ia 10 meneti i te 37 °C i runga i te karuiti CellObserver (Zeiss) me te hongere marama whakawhiti me te FITC whakaongaonga me nga huinga tātari tuku mo te whakaahua ThT.Ka whakamahia he arotahi 20x/0.4 mo te atahanga.I whakamahia a Zen Blue (Zeiss) me ImageJ (https://imagej.nih.gov/) mo te tātari whakaahua.I whakaritea hoki nga kaera mai i nga otinga NT me His-NT2RepCT i te kukū o te 50 mg/mL kei roto te 20 mM Tris pH 8 me te 5 µM ThT me te incubated i te 37°C mo te 90 min.I whakawhitia nga wahanga ra ki tetahi puna hou kei roto te 20 mM Tris, pH 8, me te 5 μM ThT i roto i te pereti raro 96 pai kore herea.Tikina te korakora kaakaariki me nga whakaahua mara kanapa i te 20x/0.4 te whakanui.I whakamahia te ImageJ mo te tātari whakaahua.
Otinga NMR tūāwhiorangi i whiwhi i te 310 K i runga i te 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer me te QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Ko nga tauira NMR kei roto ko te 10 mg/mL te pūmua homogeneous kua tapaina ki te 13C, 15N, kua memeha ki te 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Ko nga nekehanga matū o te NT2RepCT i te pH 6.7 i whakamahia hei tohu i te tihi 23 i roto i te awhi 2D o 15N-HSQC.
Ko te koki makutu e huri ana i te tuāwhiowhio NMR (MAS) totoka o 13C, 15N-tapanga hydrogels i tuhia ki runga i te Bruker Avance III HD spectrometer i 800 MHz me te 3.2 mm 13C/15N{1H} tirotiro hiko kore.I whakahaeretia te tauira pāmahana ma te whakamahi i te rerenga hau pāmahana rereke i te 277 K. Ko te resonance rotational resonance rua-ahu (DARR)76 me te honohono-a-reo irirangi (RFDR) 77 i riro i nga waahanga MAS o 12.5 kHz me 20 kHz, ia.Ko te whakawhitinga whakawhiti (CP) mai i te 1H ki te 13C i mahia ma te whakamahi i te rarangi raina mai i te 60.0 ki te 48.0 kHz i te 1H, 61.3 / 71.6 kHz i te 13C (i te 12.5 / 20 kHz MAS) me te wa whakapiri 0.5-1 ms.Spinal6478 decoupling i 73.5 kHz i whakamahia i roto i te kohinga raraunga.Ko te wa whiwhi ko te 10 milliseconds me te roa o te huringa ko te 2.5 hēkona.Ko nga hononga hono-kotahi Cα/Cβ i kitea i roto i te RFDR spectra i tohua i runga i nga ahuatanga o nga nekehanga matū momo toenga me nga hononga hono-maha i roto i te tirohanga DARR.
I whakamahia te putunga raraunga Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ki te arotake i te ahua o te pupuhi me te kaha Rosetta mo NT, NTFlSp, me NTMiSp.Ko te putunga raraunga Zipper e tarai ana i a Rosetta Energy80, e whakakotahi ana i nga mahi hiko kore utu hei whakatauira me te tātari i te hanganga pūmua.Ko te taumata o te kaha o te -23 kcal/mol iti iho ranei e tohu ana i te kaha nui ki te fibrillate.Ko te iti ake o te kaha o te kaha ake o nga whenu β e rua i roto i te hanganga kumemau.I tua atu, i whakamahia te Waltz algorithm ki te matapae i nga rohe amyloidogenic i NT, NTFlSp me NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
I konatunatuahia te wairewa pūmua NT ki te 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) parepare i te pH 5.5 me te 6.0 hei whakaheke i te pH ki te pH 6 me te 7.Ko te kohinga pūmua whakamutunga ko 100 mg/ml.
I mahia nga ine i runga i te J-1500 CD spectrometer (JASCO, USA) ma te whakamahi i te 300 μL cuvette me te ara whatu o 0.1 cm.I diluted nga pūmua ki te 10 μM (n = 1) i roto i te 20 mM phosphate buffer (pH 8).Hei tātari i te pūmautanga pūmua i te aroaro o te tote, i tātarihia nga pūmua i te kukū kotahi (n = 1) i roto i te 20 mM phosphate buffer (pH 8) kei roto 154 mM NaF, NaCl ranei.I tuhia nga matawai i te 222 nm mai i te 25 ° C ki te 95 ° C me te tere whakawera o te 1 ° C / min.I tātaihia te ōwehenga o ngā pūmua kua takai māori mā te tātai (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).I tua atu, e rima nga tohu i tuhia mo ia tauira mai i te 260 nm ki te 190 nm i te 25°C me muri i te whakamahana ki te 95°C.E rima nga tuāwhiorangi i tauwaenga, whakaene, ka huri ki te molar ellipticity.I tātarihia nga raraunga ma te whakamahi i te Prism 9.
Ko te kaha o te rewharewha o tana-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) i inehia i roto i te taarua (n = 3) i roto i nga papa 96-poka me te pango pango o raro (Corning Glass 3881, USA) i raro i nga tikanga pateko.Inehia nga tauira me te kaipanui pereti e pa ana ki te korikori me te roangaru whakahihiri o te 395 nm, ka tuhi i te tukunga ki te 509 nm i mua i te whakangao me te 2 haora i muri mai i te 37°C.I tātarihia nga raraunga me te Prism 9.
I whakamahia te kete purine nucleoside phosphorylase (te tikanga fluorometric, Sigma Aldrich) i runga i nga tohutohu a te kaihanga.Hei ine i nga mahi i roto i nga reera me nga otinga kei roto i tana-NT-PNP, uruhia te 10 ng o His-NT-PNP ki te 100 mg/mL NT ki te tapeke o te 2 µL na te mea i hoatu e te reera he tohu kei runga ake i te waahi kitenga o te huinga.Ko nga mana whakahaere mo nga kaera me nga otinga kaore he Tona-NT-PNP i whakauruhia.I mahia e rua nga inenga (n = 2).I muri i te inenga o te mahi, ka tangohia te ranunga tauhohenga, ka whakaahuahia te reera kia mau tonu te reera i te wa e ine ana.I tātarihia nga raraunga ma te whakamahi i te Prism 9.
Mo etahi atu korero mo te hoahoa ako, tirohia te waahanga rangahau Nature e hono ana ki tenei tuhinga.
Ko nga ahua 1 me te 2 e whakaatu ana i nga raraunga tuatahi.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, me te 6, Pikitia Tāpiri.3, piki piki.5a, d, piki taapiri.6 me te pikinga taapiri.8. Ko nga Raraunga Raraunga mai i tenei rangahau e whakahaerehia ana i roto i te putunga raraunga Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Ko nga raraunga NMR i whiwhi i tenei rangahau i whakairihia ki te whare pupuri BMRGi i raro i te whakauru ID bmrbig36.Ko nga hanganga o te GFP me te PNP i tangohia mai i te PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. and Johansson, J. Te hurihuri hiraka pungawerewere horihori.Matū Motu.koiora.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.E whakaatu ana te ira tangata o Nephila clavipes i te kanorau o nga ira hiraka pungawerewere me o raatau korero uaua.National Genette.49, 895–903 (2017).