347 12.7*1.24mm ngongo kowiri tira kowiri tira , Hangaia rapoi o te tukutahi hiko condensation me te whakakotahitanga o te α-synuclein me te tau

Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Kei te whakamahi koe i tetahi putanga tirotiro me te tautoko CSS iti.Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tua atu, hei whakarite i te tautoko tonu, ka whakaatuhia e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Rēreti e whakaatu ana i nga tuhinga e toru mo ia kiriata.Whakamahia te patene o muri me te taha o muri hei nuku i roto i nga kiriata, ko nga paatene mana kiriata kei te pito ki te neke ma ia kiriata.

347 Whakatakotoranga Paipa Kowiri tira

347 12.7*1.24mm ngongo kowiri tira

Diameter o waho: 6.00 mm OD tae atu ki te 914.4 mm OD, Rahi ki te 24" NB e waatea ana Ex-stock, OD Rahi Steel Tubes e waatea ana Ex-stock

SS 347 Awhe Matotoru Paipa: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc.

Momo: SS 347 Paipa Korekore |SS 347 ERW Paipa |SS 347 Paipa Paihere |SS 347 Paipa Hanga |SS 347 CDW ngongo, LSAW Paipa / Tuhia-Werohia / Whakahoutia

Puka: SS 347 Nga Paipa Porowhita/ Ngongo, SS 347 Nga Paipa Tapawha/ Ngongo, SS 347 Paipa Tapawhā/ Ngongo, SS 347 Ngongo Porowhita, SS 347 "U" Hanga, SS 347 Pan Keke Coils, SS 347 ngongo Hydraulic

Roa: Takitahi Tupono, Matapihi Taurua & Whakamutunga Roa e hiahiatia ana: Whakamutunga Maama, Whakamutunga Beveled, Taahihia

Parenga Whakamutunga: Potae Kirihou |Whakaoti i waho: 2B, No.4, No.1, No.8 Mirror Mutu mo nga Paipa Kowiri tira, Whakaoti i runga i nga Whakaritenga a te kaihoko

Te Tikanga Tukunga: Kua Ahia me te Piki, Kua Whakakohia, Kua Maamaa, Kua Toia Matao

Tirotiro, Ripoata Whakamatau: Tiwhikete Whakamatau Miihini, EN 10204 3.1, Ripoata matū, Ripoata Miihini, Ripoata Whakamātautau PMI, Ripoata Tirotiro Ataata, Ripoata Tirohanga Ranga Tuatoru, Ripoata Taiwhanga Whakaaetanga NABL, Ripoata Whakamatau Kino, Ripoata Whakamatau Karekau

Taapiri: Kii i roto i nga Pouaka Rakau, Peeke Kirihou, Paihere Tiihini Paihere, i runga ranei i nga tono a nga Kaihoko.

Motuhake: Nga Rahi me nga Whakatakotoranga i tua atu i runga ake ka taea te hanga i runga i te tono

SS 347 Rahi Rahi Pipa:1/2 inihi NB, OD ki te 24 inihi

ASTM A312 347: He paipa paipa austenitic he paipa mo te wera teitei me te tuitui tika.Karekau e whakaaetia te whakarewa whakakī i te wa e whiri ana.

ASTM A358 347: Ko te whakakotahitanga hiko he paipa paipa austenitic mo te mahi whakakino me te wera nui/ranei.Ko te tikanga ko te paipa noa ki te 8 inihi ka mahia ki tenei whakaritenga.Ko te taapiri i te whakarewa whakakii ka whakaaetia i te wa o te whakapiri.

ASTM A790 347: He paipa paipa ferritic/austenitic (duplex) he paipa tuitui me te torotika-tika mo te mahi haupapa whanui, me te aro nui ki te aukati i te pakaru o te waikura.

ASTM A409 347: Tuinga-tika, tui-piripiri ranei te whakakotahitanga hiko i paiherea te whanui nui austenitic putorino pakitara rama i roto i te rahi 14" ki te 30" me nga pakitara Sch5S me Sch 10S mo te pirau me te teitei / teitei.

ASTM A376 347: paipa austenitic tuitui mo nga tono pāmahana teitei.

ASTM A813 347: Tuinga-kotahi, paipa austenitic paipa kotahi-rua-rua ranei mo te teitei o te pāmahana me nga tono haupapa whanui.

ASTM A814 347: He paipa paipa austenitic kua oti te mahi makariri mo te wera nui me te ratonga haukino whanui.

347H Kowiri tira Paipa Matū Hanga

Kowiri tira 347H Paipa Nga Taonga Miihini

Kowiri tira 347H Paipa Tikanga Tinana

Ko nga Tohu Taurite mo te 347H Paipa Kowiri tira

Ko te whakahiatotanga o te Amyloid alpha-synuclein (αS) he tohu tohu mo te mate a Parkinson me etahi atu synucleinopathies.Ina tata nei, ko te pūmua tau e hono ana ki te mate a Alzheimer kua hono ki te αS pathology, a, i kitea e noho tahi ana i roto i nga whakaurunga taonga αS, ahakoa kei te noho marama tonu te tikanga irapoi o te whakakotahitanga o nga pūmua e rua.Ko ta matou korero i konei ka wehe te wahanga αS ki roto i te wai condensate na roto i te condensation matatini electrostatic me nga polypeptides pai te utu penei i te tau.I runga i te hononga o te αS mo nga polycations me te tere o te paheketanga o te valence o te whatunga coagulation, ka tere te whakahiato, te whakakotahitanga ranei ka whai muri i te whakahiato amyloid puhoi.Na roto i te whakakotahi i te huinga o nga tikanga koiora matatau, i taea e matou te tohu i te wehenga wahanga wai-wai αS/Tau me te tautuhi i nga mea matua e arahi ana ki te hanganga o nga whakahiato rerekee kei roto nga pūmua e rua i roto i te condensate pūmua wai.
I tua atu i nga waahanga membrane, ka taea hoki te wehe mokowā i roto i nga pūtau ma te hanga o nga tinana kikorangi-wai-wai-wai e kiia nei ko te condensates biomolecular ranei, na roto i te tukanga e kiia nei ko te wehenga wai-wai (LLPS).Ko enei rūrūtia he mea hanga e te tauwhitiwhiti-a-tinana maha, i te nuinga o te waa i waenga i nga pūmua, i nga pūmua ranei me te RNA, he maha nga mahi i roto i te nuinga o nga punaha ora.He maha nga pūmua e kaha ana ki te LLP e whakaatu ana i nga raupapa o te uaua iti e tino raruraru ana i roto i te taiao me te hanganga o te condensates biomolecular3,4,5.He maha nga rangahau whakamatautau i whakaatu i te ahua ngawari, he maha, he maha hoki te ahua o nga pūmua e hanga ana i enei condensate rite ki te wai, ahakoa he iti noa te mohio mo nga whakatau irapo motuhake e whakahaere ana i te tipu me te pakeke o enei condensates ki te ahua totoka ake. āhua..
Ko nga raraunga hou e tautoko ana i te whakapae ko te LLPS e peia ana e te pūmua me te whakarereketanga o nga rūpahu ki roto i nga hanganga totoka pea he huarahi pūkoro e tika ana e arai atu ana ki te hanga o nga whakahiato paitini kore e rewa he tohu tohu mo nga mate whakaheke.He maha nga LLPS e pa ana ki nga pūmua whakararu kino (IDP), he nui te utu me te ngawari, kua roa e hono ana ki te neurodegeneration na roto i te tukanga o te whakahiato amyloid.Ina koa, ko nga kondensate IDP koiora penei i te FUS7, te TDP-438 ranei, ko nga pūmua me nga rohe matatini iti nui penei i te hnRNPA19 kua whakaatuhia ki te pakeke ki te ahua o te kiri, tae noa ki nga ahua totoka na roto i te tukanga e kiia nei ko te wai.pūhui.ki te whakawhitinga wahanga totoka (LSPT) hei mahi o te wa, hei whakautu ranei ki etahi whakarereketanga i muri i te whakamaoritanga, i nga huringa pathologically tino nui1,7.
Ko tetahi atu IDP e hono ana ki te LLPS i roto i te vivo ko Tau, he pūmua whakararu e pa ana ki te microtubule, kua uru te whakahiato amyloid ki te mate o Alzheimer10 engari no na tata nei i uru ki te mate o Parkinson (PD) me etahi atu proteinopathies karihi synaptic 11, 12, 13 he hononga.Kua kitea kua wehe noa a Tau mai i te wairewa/cytoplasm na te pai o te tauwhitinga hiko14, ka puta mai te hanganga o nga rūrūtia whakarangatira-tau e mohiotia ana ko te electrostatic coacervates.Kua kitea ano ko tenei momo tauwhitinga kore-motuhake ko te kaha o te taraiwa i muri i te maha o nga kondensate biomolecular i te natura15.I te take o te pūmua tau, ka taea te whakahiato hiko ma te whakahiato ngawari, i roto i nga rohe whakapae o te pūmua e whakaohooho ana i te tukanga wehenga, ma te whakahiatotanga matatini ranei ma te taunekeneke ki nga polymers kino penei i te RNA.
I tata nei, ko te α-synuclein (αS), he amyloid IDP i uru ki roto i te PD me etahi atu mate neurodegenerative e mohiotia ana ko te synucleinopathy17,18, kua whakaatuhia i roto i nga tauira pūtau me nga kararehe19,20 e kukū ana i roto i te condensates pūmua me te whanonga wai-rite.Ko nga rangahau in vitro i whakaatu ko te αS ka pa ki te LLPS ma te whakahiato ngawari ma te nuinga o nga taunekeneke hydrophobic, ahakoa ko tenei tukanga e hiahia ana kia tino nui te kuhanga o te pūmua me te wa whakahiato roa19,21.Ahakoa ko nga condensates kei roto i te αS e kitea ana i roto i te vivo i hangaia e tenei, etahi atu tukanga LLPS ranei, he take matua kaore ano kia whakatauhia.Waihoki, ahakoa kua kitea te αS amyloid aggregation i roto i nga neurons i roto i te PD me etahi atu synucleinopathies, ko te tikanga tika e uru ai te αS ki te whakahiato amyloid intracellular kare tonu i te marama, na te mea ko te overexpression o tenei pūmua e kore e puta ki te whakaoho i tenei mahi anake.He maha nga wa e hiahiatia ana etahi atu kino o te pūtau, e kii ana ko etahi waahi pūkoro, taiao moroiti ranei e hiahiatia ana mo te whakahou i nga huihuinga amyloid αS intracellular.Ko tetahi taiao pūtau e tino kaha ana ki te whakahiato ko te roto o te pūmua condensates 23 .
He mea whakamiharo, kua kitea te αS me te tau ki te noho tahi i roto i nga whakaurunga mate aahua i roto i te tangata whai mate a Parkinson me etahi atu synucleinopathies 24,25 me nga whakamatautau kua whakaatu he hononga pathological synergistic i waenganui i nga pūmua e rua 26,27 e whakaatu ana he hononga pea i waenga i te whakahiato αS me tau i roto i nga mate neurodegenerative.mate.Ko te αS me te tau kua kitea ki te taunekeneke me te whakatairanga i te whakahiato o tetahi ki tetahi i roto i te vitro me te vivo 28,29 me nga whakahiato rereke i hangaia i enei pūmua e rua kua kitea i roto i nga roro o nga turoro me te synucleinopathies 30.Heoi, he iti noa te mohio mo te turanga ngota o te tauwhitinga i waenga i te αS me te tau me te tikanga o tana whakahiatotanga.Kua korerohia te αS ki te mahi tahi me te tau na roto i te kukume hiko i waenga i te rohe C-terminal tino kino o te αS me te rohe nui o te proline o te tau, he mea whakarangatira ano i nga toenga pai.
I roto i tenei rangahau, e whakaatu ana ka taea e te αS te wehe ki roto i nga rūrūtia mā te condensation matatini electrostatic i te aroaro o te pūmua tau, he rereke ki tana taunekeneke ki etahi atu polypeptides pai te utu penei i te poly-L-lysine (pLK), me tenei mahi.Ka mahi a αS hei ngota ngota scaffold mo te whatunga topata.Kua kitea e matou nga rereketanga rereke i roto i te tukanga o te maoatanga o te electrostatic αS coacervates, e pa ana ki nga rereketanga o te kaha me te kaha o te taunekeneke o nga pūmua e uru ana ki te whatunga coacervate.Ko te mea whakamiharo, i kite matou i te whakakotahitanga o te αS me te tau amyloid pūmua i roto i nga coacervates wai roa, me te tautuhi i etahi take matua e arai atu ai ki te whakakotahitanga o enei pūmua e rua i roto i aua coacervates.I konei ka whakaahuahia e matou nga korero mo tenei mahi, he tikanga irapoi ka taea i raro i te kohinga o nga pūmua e rua i roto i nga whakaurunga mate-motuhake.
Kei a αS te hiku C-terminal tino anionic i te pH kūpapa (Fig. 1a), a i whakapae matou ka taea e ia te pa ki te LLPS na roto i te whakamaaramatanga o nga matatini hiko me nga ngota ngota polypeptide raruraru polycationic.I whakamahia e matou he 100-toenga poly-L-lysine (pLK) hei tauira ngota tauira na te mea he pai te utu me te raruraru o te ahua polymeric i te pH 32 kore. (Whakaahua 1b) te whakamahi i te 13C/15N-tapanga αS i te aroaro o te whakanui ake i te αS:pLK owehenga molar.Ko te taunekeneke o te pLK me te rohe-Ct o αS ka kitea i roto i nga raruraru o te nekehanga matū me te heke o te kaha o te tihi o tenei rohe o te pūmua.He mea whakamiharo, i te wa i whakaranua e matou te αS me te pLK i te kukū αS tata.5–25 µM i te aroaro o te polyethylene glycol (5–15% PEG-8) (te LLPS parepare: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) i haere tonu matou i roto i te mara whanui o te hanga pūmua. .I kitea nga rūrūtia mā te whakamahi i te karurangi (WF) me te moroiti maramara (BF) (Fig. 1c).1-5 µm maturuturunga iho kei roto te αS kukū (kua tapirihia te 1 µM AlexaFluor488-tapanga αS, AF488-αS), ka taea te ahu mai i o raatau ahuatanga hiko mai i to raatau aukati ki te 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) me tona aro ki te he piki ake te kukū o te NaCl (Fig. 1c).Ko te ahua o te wai-rite o nga coacervates o te αS/pLK electrostatic complex e whakaatuhia ana e to ratou kaha ki te whakakotahi i roto i nga milliseconds (Fig. 1d).Ma te whakamahi i te turbidimetry, ka tohua te hanganga o nga pata i raro i enei tikanga, ka whakapumautia te ahua hiko o te taunekeneke matua e pa ana ki tona pumau (Fig. 1e), me te aromatawai i te paanga o nga momo owehenga polymer i runga i te tukanga LLPS (Fig. 1f).Ahakoa ka kitea te hanganga o te maturuturunga iho i runga i te whānuitanga o nga owehenga polymer, he tino pai te mahi ina he nui ake te pLK i te αS.Kua kitea ano nga LLP ma te whakamahi i te matū rereke rereke dextran-70 (70 kDa), te whakamahi ranei i nga momo tauira tauira, tae atu ki nga maturuturunga kiriata karaihe, nga puna moroiti o nga momo rauemi, Eppendorf, quartz capillaries ranei.
he tohu hoahoa o nga rohe pūmua rereke i roto i nga momo rereke WT-αS me ΔCt-αS i whakamahia i roto i tenei rangahau.Ko te rohe amphipathic N-terminal, te rohe hydrophobic amyloid-forming (NAC), me te rohe C-terminal kino e whakaatuhia ana i te puru, te karaka, me te whero.Ka whakaatuhia te Mapi Net Charge Per Residual (NCPR) o WT-αS.b NMR tātaritanga o te αS/pLK pāhekoheko i roto i te kore o te macromolecular clumps.Ka piki ake te kukū o te pLK (αS:pLK molar ōwehenga o 1:0.5, 1:1.5, me te 1:10 e whakaatuhia ana i roto i te kaakaariki marama, te kaakaariki, me te kaakaariki pouri.c Coacervate αS/pLK (molar ratio 1:10) ki te 25 µM (1 µM AF488-labeled αS or Atto647N-labeled pLK for WF atahanga) i roto i te LLPS buffer (runga), ka taapirihia ranei ki te 500 mM NaCl (raro maui) i muri ranei i te 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; raro matau).Pae tauine = 20 µm.d Ko nga whakaahua moroiti o te BF droplet fusion o αS/pLK (molar ratio 1:10) i te kukū o te 25 μM;Ko nga pere e tohu ana i te whakakotahitanga o nga pata takitahi (pere whero me nga pere kowhai) ki tetahi maturuturu hou (pere karaka) i roto i te 200 ms).Pae tauine = 20 µm.e Marara marama (i te 350 nm) αS/pLK whakahiato i roto i te LLPS buffer i mua me muri i te taapiri o te 500 mM NaCl, 10% ranei 1,6-HD i te 25 µM αS (N = 3 tauira tauira, te tikanga me te inenga paerewa kua tohua).f BF whakapakoko (runga) me te tātari marara marama (i te 350 nm, raro) o te whakahiatotanga αS/pLK i te 25 μM αS me te piki ake o te αS:pLK molar ratio (N = 3 tauira tauira, te tikanga me te inenga paerewa kua tohua hoki).Pae tauine = 10 µm.Ko te pae tauine i runga i te ahua kotahi e tohu ana i te tauine o nga whakaahua katoa i te papa kotahi.Ka whakaratohia nga raraunga mata ki te ahua o nga konae raraunga mata.
I runga i o maatau kitenga mo te αS/pLK electrostatic complex condensation me nga kitenga o mua mo te αS hei ngongo ngota kiritaki o te tau/RNA condensate na roto i te taunekeneke tika ki te tau31, i whakapaehia ka taea e te αS me te tau te wehe tahi me te whakarewa i te kore o te RNA. whakatōhau.na roto i nga matatini hiko, a ko αS te pūmua scaffold i roto i te αS/Tau coacervates (tirohia te tohatoha utu tau i te Whakaahua 2e).I kite matou i te wa i konatunatuahia te 10 μM αS me te 10 μM Tau441 (kei roto te 1 μM AF488-αS me te 1 μM Atto647N-Tau) ki roto i te LLPS buffer, he ngawari te hanga i nga whakahiato pūmua kei roto i nga pūmua e rua, i kitea e te WF microscopy.(Whakaahua 2a).Ko te kohinga o nga pūmua e rua i roto i nga rūrūtia i whakapumautia e te miihini confocal (CF) (Taapiri Fig. 1a).He rite te ahua i kitea i te wa i whakamahia ai te dextran-70 hei kaihoko whakahiato (Taapiri Whakaatu 1c).Ma te whakamahi i te PEG, i te dextran ranei, i tohuhia e te FITC, i kitea he rite tonu te tohatoha o nga kaihoko roopu e rua puta noa i nga tauira, kaore he wehewehenga, he hononga ranei (Taupiri Fig. 1d).Engari, e kii ana i roto i tenei punaha ka whakatairangahia te wehenga o te wahanga na roto i nga paanga o te tini o te macromolecular, na te mea ko te PEG he maataki kaipanui tino pai, pera i te kite i etahi atu punaha LLP33,34.Ko enei rūrūtia-taonga pūmua i aro ki te NaCl (1 M) engari kaua ki te 1,6-HD (10% v/v), e whakau ana i o raatau taonga hiko (Taapiri Fig. 2a, b).I whakapumauhia to ratau whanonga wai ma te mataki i nga takahanga o te millisecond hanumi ma te whakamahi i te miihini BF (Fig. 2b).
he whakaahua moroiti Confocal (CF) o αS/Tau441 e whakakotahi ana i roto i te LLPS buffer (10 μM o ia pūmua, 0.5 μM o AF488-labeled αS me Atto647N-labeled Tau441).b Ko nga whakaahua rereke rereke rereke (DIC) o te αS/Tau441 nga takahanga whakahiatotanga maturuturu (10 μM mo ia pūmua).c Hoahoa wahanga i runga i te marara marama (i te 350 nm) o Tau441 LLPS (0–15 µM) i te ngaro (taha maui) i te aroaro ranei (matau) o 50 µM αS.Ko nga tae mahana ake e tohu ana i te marara ake.d Te marara marama o nga tauira αS/Tau441 LLPS me te whakanui ake i te kukū o te αS (Tau441 i te 5 µM, N = 2–3 tauira tukuruatanga e tohuhia ana).e Whakaaturanga mahere o etahi momo momo pūmua tau me nga rohe rereke o te pūmua e whakamahia ana i roto i tenei rangahau: te rohe N-terminal (whero), te rohe whai rawa proline (puru), te rohe microtubule-binding (MTBD, kua tohua ki te karaka), me torino takirua hanga amyloid.rohe kakawaea (PHF) kei roto i te MTBD (hina).Kua whakaatuhia te mahere Net Charge Per Residue (NCPR) o Tau441.f Ma te whakamahi i te 1 µM AF488-labeled αS me te Atto647N-labeled ΔNt-, ma te whakamahi i te 1 µM AF488-labeled αS or ΔCt-αS i te aroaro o ΔNt-Tau (runga, 10 µM mo ia pūmua) K18 ranei (raro, 50 µM ) ) ) nga moroiti o te WF kua whakapoapoa i roto i te LLPS, i te K18 papaa ranei.Ko nga pae tauine o te ahua kotahi e tohu ana i te tauine o nga whakaahua katoa i te papa kotahi (20 µm mo nga panui a, b me te f).Ko nga raraunga mata mo nga panui c me d ka tukuna hei konae raraunga mata.
Hei whakamatautau i te mahi a te αS i roto i tenei tukanga LLPS, i tirotirohia e matou i te tuatahi te paanga o te αS ki te pumau o te topata ma te nephelometry ma te whakamahi i te piki haere o te NaCl (Fig. 2c).Ko te teitei ake o te kukū o te tote i roto i nga tauira kei roto te αS, ka nui ake nga uara marara marama (i te 350 nm), e tohu ana i te mahi whakapumau a αS i roto i tenei punaha LLPS.Ka kitea he paanga rite ma te whakanui ake i te kukū αS (no reira te αS:Tau441 ōwehenga) ki te tata.10-fold te pikinga e pa ana ki te kukū tau (5 µM) (Fig. 2d).Hei whakaatu ko te αS he pūmua scaffold i roto i nga coacervates, i whakatau matou ki te tirotiro i te whanonga o te mutant Tau kua pakaruhia e te LLPS, kaore he rohe-N-terminal kua toha kino (te toenga 1-150, tirohia te Fig. 2e) e kiia nei ko ΔNt-Tau.Ko te WF moroiti me te nephelometry i whakapumau ko ΔNt-Tau ake kaore i pa ki te LLPS (Whakaahua 2f me te Whakaaturanga Tāpiri 2d), pera i te korero i mua i te 14. Heoi, i te wa i whakauruhia ai te αS ki nga otinga marara o tenei momo Tau kua tapahia, kua tino rite te tukanga LLPS. kua whakahokia mai me te kiato maturuturu tata ki te kiato maturuturu o nga otinga rahi-katoa o Tau me te αS i raro i nga ahuatanga rite me nga kukū pūmua.Ka taea hoki te kite i tenei tukanga i raro i nga ahuatanga o te iti o te mahanga macromolecular (Taapiri Fig. 2c).Ko te mahi o te rohe C-terminal αS, engari ehara i te roa o te roa, i roto i te tukanga LLPS i whakaatuhia e te aukati i te hanganga o te maturuturu ma te whakamahi i te momo C-terminal αS kua tapahia te kore o nga toenga 104-140 (Fig. 1a) o te (ΔCt- αS) pūmua (Fig. 2f me te Tāpiri Fig. 2d).Ko te kohinga o te αS me te ΔNt-Tau i whakamanahia e te microscopy fluorescence confocal (Taupiri Fig. 1b).
Hei whakamatautau ano i te tikanga LLPS i waenga i te Tau441 me te αS, i whakamahia he momo rereke Tau, ara ko te kongakonga helical filament core (PHF) takirua i roto i te rohe microtubule-binding (MTBD), mena kei roto e wha nga waahanga tukurua, e mohiotia ana ano. hei wahanga K18 (tirohia te 2e).No na tata nei i korerohia ko te αS he pai ki te here ki tetahi pūmua tau kei roto i te rohe whai rawa-proline i roto i te raupapa i mua i te rohe microtubule-binding.Heoi ano, he nui ano te rohe o te PHF i nga toenga pai (tirohia te Whakaahua 2e), ina koa ko te lysine (15% nga toenga), i akiaki i a maatau ki te whakamatautau mena ka whai waahi ano tenei rohe ki te whakamaaramatanga o te matatini αS/Tau.I kite matou kaore e taea e K18 anake te whakaoho i te LLPS i nga kohinga ki te 100 μM i raro i nga tikanga i whakamatauria (LLPS buffer me te 15% PEG, 20% dextran ranei) (Whakaahua 2f).Heoi, i te wa i tapirihia e matou te 50 µM αS ki te 50 µM K18, ka kitea te tere o te hanga o nga pata pūmua kei roto K18 me te αS e te nephelometry (Taupiri Fig. 2d) me te WF microscopy (Fig. 2f).I te mea i tumanakohia, kaore i taea e ΔCt-αS te whakaora i te whanonga LLPS o K18 (Fig. 2f).Ka kite matou ko te whakahiatotanga αS/K18 e hiahia ana kia paku teitei ake te kukū o te pūmua ki te whakaawe i te LLPS ki te αS/ΔNt-Tau, ki te αS/Tau441 ranei, he rite etahi atu mea.He rite tenei ki te kaha ake o te taunekeneke o te rohe αS C-terminal me te rohe Proline-taonga Tau i whakaritea ki te rohe microtubule-binding, pera i te korero i mua 31.
I te mea kaore e taea e ΔNt-Tau te mahi LLPS i te kore o te αS, i whiriwhiria e matou tenei momo Tau hei tauira mo te tohu αS/Tau LLPS i runga i te ngawari o nga punaha LLPS me te Tau-roa (isotype, Tau441/Tau441).me nga tukanga whakahiato uaua (heterotypic, αS/Tau441).I whakatauritea e matou te tohu o te whakahiato αS (hei wahanga o te pūmua wahanga condensed, fαS,c) i roto i nga punaha αS/Tau me αS/ΔNt-Tau ma te centrifugation me te wahanga marara SDS-PAGE tātaritanga (tirohia te 2e), i kitea nga uara tino rite. mo nga pūmua katoa i te kukū kotahi.Ina koa, i riro mai i a maatau te fαS,c 84 ± 2% me te 79 ± 7% mo te αS/Tau me te αS/ΔNt-Tau, e tohu ana he pai ake te tauwhitiwhitinga heterotypic i waenga i te αS me te tau i te tauwhitinga i waenga i nga ngota ngota tau.i waenganui.
Ko te taunekeneke me nga momo polycations me te paanga o te tukanga whakamaarama i runga i te αS kinetics i ako tuatahihia e te whakaoranga o te fluorescence i muri i te whakamaarama whakaahua (FRAP).I whakamatauria e matou te αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau me te αS/pLK coacervates (100 μM αS kua taapirihia me te 2 μM αS AF488-αS me te 100 μM Tau441, ΔNt-Tau ranei 1 mM pLK).I whiwhi raraunga i roto i nga meneti 30 tuatahi i muri i te whakaranu i nga waahanga tauira.Mai i nga whakaahua FRAP kanohi (Fig. 3a, αS/Tau441 condensation) me o ratou pihinga akoranga wa e rite ana (Fig. 3b, Tāpiri Pikitia 3), ka kitea he tino rite te kinetics αS ki era o Tau441 coacervates.me te ΔNt-Tau, he tere ake ki te pLK.Ko nga whakarea diffusion kua tatauhia mo te αS i roto i te coacervate e ai ki te FRAP (penei i te korero a Kang et al. 35) ko D = 0.013 ± 0.009 µm2/s me D = 0.026 ± 0.008 µm2/s mo te αS/TauS/s mo te αS/TauS441 te punaha αS/.pLK, Tau, me D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, ia (Fig. 3c).Heoi, ko te whakarea diffusion αS i roto i te wahanga marara he maha nga ota o te rahinga teitei ake i nga waahanga whakakoi katoa, i whakatauhia e te Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, tirohia te Whakaaturanga Tāpiri 3) i raro i nga tikanga ano (LLPS buffer) engari i te kore o nga polycations ( D = 8 ± 4 µm2/s).Na reira, ka tino heke nga kinetika o te whakamaori αS i roto i nga coacervates ka whakaritea ki nga pūmua i roto i te wahanga marara na runga i te whakahuatanga o nga hua o te rapoi ngota, ahakoa ko nga coacervates katoa e mau tonu ana te ahua o te wai i roto i te haurua haora tuatahi i muri i te hanganga, he rereke ki te wahanga tau.he tere ake te kinetics i roto i te pLK condensate.
a–c FRAP tātaritanga o αS dynamics (2% AF488-labeled αS) i roto i te electrostatic coacervates.Ko nga whakaahua o nga whakamatautau αS/Tau441 FRAP i roto i te taarua e whakaatuhia ana i te (a), ko nga porowhita whero e tohu ana i nga waahi kua whakahekehia te tae.Ko te pae tauine he 5 µm.b Nga pihinga FRAP toharite me te (c) nga whakarea whakawehenga kua tatauhia (D) mo te 5-6 (N) nga tete rereke mai i nga whakamatautau e toru ma te whakamahi i te 100 µM αS me nga kuhanga equimolar o Tau441 (whero), ΔNt-Tau (puru) ranei pLK (matomato) i te tekau nga wa te kukū o LLPS.Ko te inenga paerewa o te pihi FRAP ka whakaatuhia ki te tae marumaru.Hei whakatairite, ko te whakarea diffusion αS i roto i te wahanga marara i whakatauhia i roto i te taarua ma te whakamahi i te hihinga whakahiato fluorescence (FCS) (tirohia te Whakaaturanga 3 me nga tikanga mo etahi atu korero).d Tonu X-band EPR spectra o 100 μM TEMPOL-122-αS i roto i te LLPS buffer kahore he polycation (pango) ranei i roto i te aroaro o 100 μM Tau441 (whero) ΔNt-Tau (puru) ranei 1 mM pLK (matomato).Ko te whakaurunga e whakaatu ana i te tirohanga nui o nga raina mara kaha kei reira nga huringa tino nui.e here ana i nga pihinga o te 50 μM TEMPOL-122-αS me nga momo polycations i te kore o LLPS (kaore he PEG).Ko te kaha iti o te roopu III ka whakaritea ki te roopu II (IIII/III) o te awhiowhio EPR kua whakaritea hei whakanui ake i nga owehenga molar o Tau441 (whero), ΔNt-Tau (puru) me te pLK (matomato).Ko nga raina tae e whakaatu pai ana ki nga raraunga ma te whakamahi i te tauira here taratara me nga waahi herenga rite, motuhake hoki ki ia pihinga.Ka whakaratohia nga raraunga mata ki te ahua o nga konae raraunga mata.
Hei taapiri, i tirotirohia e matou te hihiko o te αS i roto i nga momo coacervates ma te whakamahi i te tapanga miro (SDSL) me te resonance paramagnetic hiko tonu (CW-EPR).Ko tenei tikanga kua whakamatauhia he tino whai hua ki te ripoata i te ngawari me te hihiri o te IDP me te taumira toenga tuuturu36,37,38.I tenei mutunga, i hangaia e matou nga toenga cysteine ​​​​i roto i nga mutants Cys kotahi me te whakamahi i te 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Ka tapaina e nga hua o Maleimide.Ake ake, i whakauruhia e matou nga tirotiro TEMPOL ki te waahi 122, 24 αS ranei (TEMPOL-122-αS me TEMPOL-24-αS).I te keehi tuatahi, ka arohia e matou te rohe C-terminal o te pūmua, e uru ana ki te taunekeneke me nga polycations.Engari, ka taea e te turanga 24 te tuku korero ki a tatou mo te hihikotanga katoa o nga pūmua i roto i te condensate.I roto i nga take e rua, ko nga tohu EPR i whiwhi mo nga pūmua o te wahanga marara e rite ana ki nga rauropi nitroxide i roto i te ahua tere.I muri i te wehenga o te wahanga i te aroaro o te tau, te pLK ranei (100 μM TEMPOL-αS, Tau441, ΔNt-Tau ranei i te tauwehenga o te 1:1, te pLK ranei i te tauwehenga o te 1:10), ka kitea te pikinga o te kaha o te tihi o te waa. te tuāwhiorangi EPR o αS.I whakawhānuihia te raina mate, e tohu ana i te whakahekenga o te αS reorientation kinetics i roto i nga rūrūtia i whakaritea ki te pūmua i te wahanga waimeha (Fig. 3d, Tāpiritanga Fig. 4a).Ko enei huringa ka nui ake te korero i te waahi 122. Ahakoa i te waahi 24 kaore te aroaro o te pLK i pa ki nga kinetics o te rangahau, i te waahi 122 ka tino rereke te ahua o te raina rererangi (Taupiri Fig. 4a).I te wa i ngana ana matou ki te whakatauira i te hiranga i te tuunga 122 o nga punaha αS/polycation e rua ma te whakamahi i te tauira isotropic (Whakaahua 5a taapiri) e whakamahia nuitia ana hei whakaahua i te hihiri o te IDP38,39 kua tapaina ki te miro, kaore i taea e matou te hanga ano i te hiranga whakamatautau..Ko te whaihanga mokowhiti o te tuunga o te 24 nga hurihuri rereke (Taupiri Fig. 5a).Ko tenei e tohu ana he waahi pai kei roto i te waahi o nga whiriwhiringa miro o te rohe C-terminal o αS i te aroaro o nga polycations.I te wa e whakaarohia ana te hautanga o te αS i roto i te wahanga whakamaarama i raro i nga tikanga EPR whakamatautau (84 ± 2%, 79 ± 7%, me te 47 ± 4% mo te αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, me te αS/pLK, ia-tirohia te Tāpiritanga. Whakaahua 2e o te tātaritanga raraunga c), ka kitea ko te whakawhänui i kitea e te tikanga EPR te nuinga o te whakaata i te taunekeneke o te rohe C-terminal o αS me nga momo polycations i roto i te waahanga whakaheke (te huringa matua ina whakamahi TEMPOL-122- αS), a ehara i te kondensation pūmua.Ka kitea te pikinga o te microviscosity i roto i te tirotiro.I te mea i whakaarohia, ko te EPR spectrum o te pūmua i raro i nga tikanga i tua atu i te LLPS i tino whakahokia mai i te wa i whakauruhia ai te 1 M NaCl ki te ranunga (Taupiri Fig. 4b).I roto i te katoa, ko o maatau korero e kii ana ko nga huringa i kitea e CW-EPR te nuinga o te whakaata i te taunekeneke o te rohe C-terminal o αS me nga momo polycations i roto i te waahanga taapiri, me te ahua o tenei taunekeneke me te pLK i te Tau.
Kia nui ake nga korero hangahanga mo nga pūmua i roto i te coacervate, i whakatau matou ki te ako i te punaha LLPS ma te whakamahi i te NMR hei otinga.Heoi ano, ka kitea noa e matou te hautanga αS e toe ana i te wahanga marara, na te hekenga o te kaha o te pūmua i roto i te coacervate me te wahanga mato kei raro o te otinga i roto i te tātaritanga NMR.I te wa i tirotirohia e matou te hanganga me te hihiri o te pūmua e toe ana i roto i te wahanga marara o te tauira LLPS ma te whakamahi i te NMR (Taupiri Fig. 5c, d), i kite matou he rite tonu te ahua o te pūmua i te aroaro o te pLK me te ΔNt-Tau, e rua o i roto i te hanganga tuarua me te hihiri o te tuara pūmua, i kitea e nga whakamatautau mo te nekehanga matū tuarua me te whakangā R1ρ.Ko nga raraunga NMR e whakaatu ana ko te C-terminus o te αS he nui te mate o te ngawari o te hangai i te wa e mau tonu ana te ahua kino, penei i te toenga o te raupapa pūmua, na ona taunekeneke me nga polycations.
I te mea ko te whakawhanui tohu CW-EPR e kitea ana i roto i te TEMPOL-122-αS te wahanga whakapoapoa e whakaatu ana i te taunekeneke o te pūmua me nga polycations, i mahia e matou he titration EPR hei arotake i te hononga hono o te αS ki nga momo polycations i te kore o LLPS (kaore he kohinga o Buffer LLPS), e kii ana he rite nga taunekeneke i roto i nga wahanga waimeha me te kukū (e whakamanahia ana e o maatau raraunga, Tāpiri 4a me te Tāpiri 6).Ko te whäinga ko te kite mena ko te whakakotahitanga katoa, ahakoa nga ahuatanga o te wai-rite noa, e whakaatu ana i nga ahuatanga rereke i raro i te taumata ngota.I te mea i tumanakohia, ka whakawhānuihia te Awhiowhio EPR me te whakanui ake i te kukū polycation, e whakaatu ana i te heke o te ngawari o te ngota i runga i nga taunekeneke ngota o nga hoa taunekeneke katoa tata ki te waatea (Fig. 3e, Tāpiritanga Fig. 6).I tutuki i te pLK tenei waiwai ki te iti ake o te molar ratio (polycation:αS) ki te ΔNt-Tau me Tau441.Inaa, ko te whakatairite o nga raraunga me te tauira here tata ki te whakaaro n nga waahi herenga rite me te motuhake i whakaatu ko te ahua o te wehenga wehe o te pLK (~ 5 μM) he raupapa o te rahi iti iho i tera o Tau441, ΔNt-Tau ranei (~50 μM ).µM).Ahakoa he tata tata tenei, e tohu ana he pai ake te hononga o te αS mo nga polycation ngawari me nga rohe utu pai tonu.I runga i tenei rereketanga o te hononga i waenga i te αS me nga momo polycations, i whakapae matou he rereke nga ahuatanga o te wai i roto i te waa ka pa ki nga momo LSPT.
I runga i te tino kikii o te taiao i roto i te coacervate pūmua me te ahua amyloid o te pūmua, i kite matou i te whanonga o te coacervate i roto i te waa ki te kite i nga tikanga LSPT ka taea.Ma te whakamahi i te miihini BF me te CF (Whakaahua 4), ka kite matou ka whakakotahi te αS/Tau441 ki te otinga, ka hanga i nga pata nui e pa ana me te whakamakuku i te mata o raro o te puna/kiriata hei maatatanga katoa, pera i te mea e tumanakohia ana. .7d);ka kiia e matou enei hanganga o raro he "raft protein".Ko enei hanganga i mau tonu te wai i te wa e mau tonu ana te kaha ki te whakakotahi (Taupiri 7b) ka kitea mo etahi haora i muri i te whakaoho o te LLPS (Whakaahua 4 me te Whakaaturanga 7c).I kite matou he pai ake te mahi makuku ki runga i te mata o te hydrophilic, kaua ki nga rauemi hydrophobic (Taupiri Fig. 7a), i runga i te tumanako mo nga coacervates hiko me nga utu kore taurite, na reira he nui te hiko o te mata.Ko te mea nui, ko te whakakotahitanga o te αS/ΔNt-Tau me te rafting i tino whakahekehia, i te mea ko te αS/pLK condensates i tino heke (Fig. 4).I roto i te wa poto o te incubation, ka taea e nga pata αS/pLK te whakakotahi me te whakamakuku i te mata hydrophilic, engari ka mutu te mahi nei, a, i muri i nga haora 5 o te heki, he iti noa nga huihuinga whakakotahi me te kore makuku i kitea.– te whakawhiti kiri-rere.
BF māngai (panene tauine) me CF (panihi matau, AF488-tapanga αS i roto i te kakariki) o nga tauira coacervate kei roto 100 µM αS (1% tapanga fluorescent) i roto i te LLPS buffer i te aroaro o te 100 µM Tau441 (runga) fluorescence moroiti whakaahua. -Tau (pokapū) 1 mM pLK ranei (raro) i nga wa rereke me te teitei o te arotahi (z, te tawhiti mai i te raro o te puna pereti).I tukuna nga whakamatautau 4-6 nga wa takitahi o tetahi ki tetahi me nga hua rite.Ko nga coacervates αS/Tau441 ka makuku i muri i te 24 haora, ka nui ake te ahua i te ahua.Ko te pae tauine mo nga whakaahua katoa he 20 µm.
Ka patai matou mena ko nga puna wai-a-whare nui i hangaia i roto i te αS/Tau441 LLPS ka arahi ki te whakahiato amyloid o tetahi o nga pūmua i akohia.I whai matou i te maoatanga o αS/Tau441 droplets i roto i te wa me te WF microscopy i raro i nga ahuatanga o runga ake nei, engari ma te whakamahi i te 1 μM AF488-labeled αS me Atto647N-labeled Tau441 (Fig. 5a).Ka rite ki te tumanako, i kite matou i te whakaurunga o te pūmua puta noa i te tukanga matuatanga.He mea whakamiharo, mai i ca.I muri i nga haora e 5, ka kitea he kaha ake nga hanganga kore porowhita i roto i nga rafts, i kiia e matou he "points", ko etahi i whakakoohia ki te αS, ko etahi i whakarangatira ki Tau441 (Fig. 5a, pere ma).Ko enei waahi kua kitea i nga wa katoa i roto i nga raft mo te αS/ΔNt-Tau i te αS/ΔNt-Tau.Karekau he waahi motuhake i roto i nga maturuturunga iho o te pLK me te punaha Tau kaore e kaha ki te whakakotahi/makuku.Hei whakamatautau mena he whakahiato rite-amyloid enei piro kei roto αS me Tau441, i mahia e matou he whakamatautau rite ma te whakamahi i te miihini CF i tapaina a Tau441 ki te Atto647N me te 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) i taapiri mai i te timatanga.waikano.Ahakoa karekau i kitea te whakakikoruatanga o ThT o te αS/Tau441 nga topata me nga rafts ahakoa i muri i te 24 haora o te incubation (Fig. 5b, rarangi runga—te toenga o nga pata i runga i nga raft protein), he tino ngoikore nga hanganga ThT-positive kei roto Atto647N-Tau441 i roto i nga rafts.he tauira tenei i te rahi, te ahua, me te waahi o nga waahi kua whakaahuatia i mua ake nei (Fig. 5b, rarangi waenga me raro), e tohu ana tera pea ka rite nga waahi ki nga whakahiato-amyloid i hangaia i roto i nga kohinga wai tawhito.
WF 25 μM αS i nga wa incubation me te teitei o te arotahi (z, te tawhiti mai i te raro karekau) i te aroaro o te 25 μM Tau441 (1 μM AF488-tapanga αS me te Atto647N-tapanga Tau441) i roto i te puna o te pereti microscope me te buffer LLPS) .E ono nga whakamatautau i tukuna takitahi me nga hua rite.b CF whakaahua moroiti o 25 μM αS i te aroaro o 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-tapanga Tau441) me te 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Ko nga topata pūmua taumaha me nga raiti pūmua kua takoto me nga waahi ka whakaatuhia ki nga rarangi o runga me waenga.Ko te rarangi o raro e whakaatu ana i nga whakaahua o nga raft me nga taka mai i nga tauira motuhake e 3.Ko nga pere ma e tohu ana i nga tohu ThT-pai i roto i nga panui e rua.Ko te pae tauine mo nga whakaahua katoa he 20 µm.
Hei tirotiro i nga huringa i roto i te whatunga pūmua coacervate i te wa o te whakawhiti mai i te wai ki te totoka, i whakamahia e matou te whakaata o te ora o te fluorescence (FLIM) me te Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (Whakaahua 6 me nga Whakaahua Tāpiri 8 me 9).I whakapae matou ko te maoatanga o te paparanga ki roto i te hanganga pūmua whakahiato, he rite tonu ki te totoka, ka tata atu te whakapiringa i waenga i te pūmua me te rangahau karewharewha e piri ana ki a ia, tera pea ka puta he paanga tinei ka kitea i roto i te wa poto o te rangahau (τ) , pera i korero i mua40.,41 ,42.I tua atu, mo nga tauira tapanga-rua (AF488 me Atto647N hei kaikoha FRET me te waikano kaikawe, ia), ka taea hoki tenei hekenga o te τ ki te whakaahuru coacervate me te pikinga o te kaha o te FRET(E) i roto i te LSPT.I tirotirohia e matou te hanga waka me te waahi i roto i te waa i roto i nga tauira LLPS αS/Tau441 me αS/ΔNt-Tau (25 µM o ia pūmua i roto i te LLPS buffer kei roto 1 µM AF488 kua tapaina he αS me/ranei Atto647N kua tapaina Tau441, ΔNt-Tau ranei).I kite matou i te ahua whanui i te mea kua heke paku te roanga o te rewharewha o te AF488 (τ488) me te Atto647N (τ647N) i te wa e pakeke ana nga coacervates (Fig. 6 me te Tāpiri 8c).Ko te mea whakamere, i tino whakanuia tenei huringa mo nga ira i roto i nga rafts (Fig. 6c), e tohu ana i puta ano te tohanga pūmua ki nga ira.Hei tautoko i tenei, karekau he huringa nui i roto i te roanga o te rewharewha i kitea mo nga maturuturunga iho o te αS/ΔNt-Tau mo te 24 haora (Taapiri Fig. 8d), e kii ana ko te whakamaaramatanga o te topata he tukanga rereke mai i te waahi karekau i te whai tahi me te nui o te whakaraupapatanga ngota. roto coacervates.Me tohu he rereke nga rahi o nga ira me nga ihirangi rereke i roto i te αS, ina koa mo te punaha αS / Tau441 (Taupiri Fig. 8e).Ko te hekenga o te roanga o te rewharewha o te waahi i haere tahi me te piki haere o te kaha, ina koa mo Atto647N kua tapaina ko Tau441 (Taupiri Pikitia 8a), me te kaha ake o te FRET mo nga punaha αS/Tau441 me te αS/ΔNt-Tau, e tohu ana i te hauhautanga i roto i te LLPS E rima haora. i muri i te whakaoho, ka whakapoapoa nga pūmua o roto i te hiko pateko.Ka whakatauritea ki te αS/ΔNt-Tau, i kite matou i te iti iho o te τ647N me te ahua teitei ake o nga uara τ488 i nga waahi αS/Tau441, i te taha o nga uara FRET iti ake, he rerekee ake.Akene, he hononga pea tenei ki te meka i roto i te punaha αS/Tau441, ko te nui o te αS i kitea me te tumanako i roto i nga whakahiato he rerekee ake, he maha nga substoichiometric ka whakaritea ki a Tau, na te mea ko Tau441 ano pea ka pa ki te LLPS me te whakahiato (Taapiri Fig. 8e) .Heoi, ko te tohu o te whakakotahitanga o te maturuturunga iho, te hanga raft, a, ko te mea nui, ko te whakahiato pūmua i roto i nga coacervates rite ki te wai he tino nui i te wa e noho ana a Tau441 me te αS.
he whakaahua moroiti rererangi mo te ora (FLIM) o αS/Tau441 me te αS/ΔNt-Tau i te 25 μM o ia pūmua (1 μM AF488-tapanga αS me te 1 μM Atto647N-tapanga Tau441 or ΔNt-Tau) i roto i te LLPS buffer.Ko nga pou e whakaatu ana i nga whakaahua o nga tauira LLPS i nga waa pakeke rereke (30 meneti, 5 haora me te 24 haora).Ko te anga whero e whakaatu ana i te rohe kei roto nga waahi αS/Tau441.Ko nga roanga o te ora e whakaatuhia ana hei pae tae.Pae tauine = 20 µm mō ngā whakaahua katoa.b Atahanga FLIM kua topa-mai o te waahi kua tohua, ka whakaatuhia ki te pouaka whero i te panui a.Ka whakaatuhia nga awhe ora ma te whakamahi i te tauine tae rite ki te papaa a.Pae tauine = 5 µm.c Ko nga tohu tohu e whakaatu ana i te AF488 (e piri ana ki te αS) ranei i te Atto647N (e piri ana ki a Tau) mo nga momo pūmua rereke (te maturuturunga iho-D-, te raft-R- me te speckle-P) i kitea i roto i nga whakaahua FLIM i tuhia mo te αS-) nga tohanga taima i te ora o Tau441 me αS/ΔNt-Tau tauira coacervate (N = 17-32 ROI mo D, 29-44 ROI mo R, me te 21-51 ROI mo nga tohu).Ko nga uara toharite me te tau waenga ka whakaatuhia he tapawha kowhai me nga raina pango i roto i nga pouaka.Ko nga rohe o raro me o runga o te pouaka e tohu ana i nga hauwha tuatahi me te tuatoru, a, ko nga uara iti me nga uara teitei i roto i te awhe 1.5-fold interquartile (IQR) ka whakaatuhia he paanui.Ko nga mea o waho ka whakaatuhia he taimana pango.I whakatauhia te hiranga o te tatauranga i waenga i nga takirua o nga tohatoha ma te whakamahi i te whakamatautau-t-rua-tauira, me te whakaaro he rereke nga rereketanga.Ka whakaatuhia nga uara p-whakamatautau-rua me nga whetūriki mo ia takirua o nga raraunga whakatairite (* uara-p > 0.01, ** uara-p > 0.001, *** uara-p > 0.0001, **** uara-p > 0.00001), ns E whakaatu ana i te koretake (p-uara > 0.05).Ko nga uara p tika ka tukuna ki te Ripanga Tāpiri 1, ka whakaatuhia nga raraunga taketake hei konae raraunga mata.
Hei whakaatu ake i te ahua o te amyloid o nga kowhatu/huinga, i mahia e matou nga tauira coacervate kore poke mo te 24 haora me te nui o te (1 M) NaCl, i puta te wehenga o nga whakahiato mai i nga coacervates pūmua.I te kitenga o nga whakahiato motuhake (arā, he otinga marara o nga whakahiato) ma te whakamahi i te microscopy kaha ngota (AFM), i kite matou i te ahua o te ahua porowhita me te teitei o te 15 nm, e hono ana i raro i nga tikanga o te kukū tote nui, he rite ki ko te whanonga o nga kaikawe amyloid na te kaha o te awe hydrophobic i runga i te mata (kia mahara ko te nuinga o nga fibrils he ~10 nm te teitei) (Taapiri Fig. 10a).Ko te mea whakamiharo, i te wa i whakamohoatia ai nga whakahiato motuhake ki te ThT i roto i te whakamatautau rewharewha ThT paerewa, i kite matou i te pikinga nui o te hua o te rahinga o te ThT fluorescence, he rite ki tera i kitea i te wa i incubated te waikano ki te αS amyloid fibrils angamaheni (Taupiri Fig. 10b), e kii ana tera kei roto i nga kohinga coacervate nga hanganga rite-amyloid..Ko te mea pono, he pai nga whakahiato ki te tote teitei o te tote engari he ngawari ki te 4 M guanidine chloride (GdnHCl), penei i nga fibrils amyloid (Taapiri Fig. 10c).
I muri mai, ka tātarihia e matou te hanganga o nga whakahiato ma te whakamahi i te rerenga ngota ngota kotahi, te whakahiatotanga o te rewharewha motuhake/whakawhitiwhiti-whakawhitiwhiti (FCS/FCCS), me te wetewetetanga pakaru o te kitenga o nga tae e rua (TCCD).Mo tenei mutunga, ka wehea e matou nga whakahiatotanga i hanga i muri i nga haora 24 o te hekitanga i roto i nga tauira 100 μl LLPS kei roto αS me Tau441 (25 μM e rua) me te 1 μM AF488-tapanga αS me te 1 μM Atto647N-tapanga Tau441.Ringihia te wairewa whakahiato marara ka puta ki te ahua mokomoko ma te whakamahi i te parepare PEG-kore me te 1 M NaCl (ko taua parepare i whakamahia hei wehe i nga whakahiato mai i te coacervate) hei aukati i nga tauwhitinga hiko i waenga i te LLPS me te pūmua.Ka kitea he tauira o te ara wa o te ngota ngota kotahi i te Whakaahua 7a.Ko te tātari FCCS/FCS (whakawhitiwhiti, CC me te autocorrelation, AC) i whakaatu he maha nga whakahiato kei roto i te αS me te tau i roto i nga tauira (tirohia te pihi CC i te Fig. 7b, te taha maui), me te nui o te toenga o te pūmua monomeric i ara ake hei a te hua o te tukanga waimeha (tirohia nga pihi AC i te Whakaahua 7b, te taha maui).Ko nga whakamatautau whakahaere i mahia i raro i nga tikanga otinga kotahi ma te whakamahi i nga tauira kei roto anake nga pūmua monomeric i whakaatu kaore he pihi CC, a he pai te pai o nga pihinga AC ki te tauira whakamaoritanga-waahanga kotahi (Eq. 4), kei reira nga pūmua monomeric i nga taunga whakamaarama e tumanakohia ana (Fig. 7b ), pae matau).He iti iho i te 1 µm2/s te whakarea turingiringi o nga matūriki whakahiato, me te 1 µm2/s o te pūmua monomeric.50–100 µm/s;he rite nga uara ki nga uara kua whakaputaina i mua mo nga fibrils amyloid αS sonicated me te αS monomeric motuhake i raro i nga tikanga otinga rite44.I te wetewete i nga whakahiato me te tātaritanga pahū TCCD (Fig. 7c, te papa o runga), i kitea i roto i ia whakahiato motuhake (αS/Tau heteroaggregate), tata ki te 60% o nga whakahiato kua kitea he αS me te tau, tata ki te 30% anake kei roto. tau, mo te 10% αS anake.Ko te tātaritanga Stoichiometric o te αS/Tau heteroaggregates i whakaatu ko te nuinga o nga heteroaggregates i whakarangatirahia i roto i te tau (stoichiometry i raro i te 0.5, ko te tau toharite o nga ngota tau mo ia whakahiato he 4 nga wa nui atu i nga ngota ngota αS), e rite ana ki ta maatau mahi i kitea i roto i te FLIM in situ. whakamātautau..I whakaatuhia e te tātaritanga FRET ko enei whakahiato nga pūmua e rua, ahakoa ko nga uara FRET mo tenei keehi ehara i te mea tino nui, na te mea ko te tohatoha o nga fluorophores ki ia whakahiato he mea ohorere na te nui o te pūmua kore tapanga i whakamahia i roto i te whakamatautau.Ko te mea whakamiharo, i te wa i mahi ai matou i taua tātaritanga ma te whakamahi i te 45,46 pakeke o te amyloid aggregation-deficient Tau rereke (tirohia te Whakaaturanga Tāpiri 11a,b), i kite matou ahakoa he rite tonu te whakahiato hiko αS (Taupiri Fig. 11c, d), Ko te kaha ki te hanga whakahiato i roto i te coacervate i tino heke, ka kitea e te FLIM etahi waahi i roto i nga whakamatautau i roto i te waahi, a, i kitea nga ngoikoretanga o te hononga-whakawhitiwhiti mo nga tauira whakahiato motuhake.Heoi, mo te iti o nga whakahiato kua kitea (kotahi whakatekau anake o Tau441), i kite matou i whakarangatirahia ia whakahiato ki te αS i tenei momo Tau, me te tata ki te 50% o nga whakahiato kua kitea kei roto anake nga ngota ngota αS, me te αS he rereke te taikaha. .nga whakahiato (tirohia te Whakaaturanga 11e), he rereke ki nga whakahiato rereke i hangaia e Tau441 (Fig. 6f).Ko nga hua o enei whakamatautau i whakaatu ahakoa ko te αS ake e kaha ki te whakaemi me te tau i roto i te coacervate, he pai ake te tau karihi i raro i enei tikanga, a ko nga whakahiato rite-amyloid ka taea te mahi hei ahua o te αS me te tau.Heoi, ka hangahia he matua-tau-tau, ka pai ake nga taunekeneke heterotype i waenga i te αS me te tau i roto i nga whakahiato i runga i nga taunekeneke homotypic i waenga i nga ngota ngota tau;ka kite hoki matou i nga kupenga pūmua i roto i te wai αS/tau coacervates.
he Representative fluorescence tohu taima o ngota ngota kotahi o nga whakahiato taratahi i hangaia i roto i te αS/Tau441 electrostatic coacervates.Ko nga pakaru e rite ana ki nga kohinga αS/Tau441 (ka pakaru i runga ake i te paepae kua tohua) i kitea i roto i nga waahana kitenga e toru (AF488 me Atto647N te tukunga i muri i te whakaoho tika, nga raina puru me te whero, te Atto647N i muri i te whakaoho kore), FRET, raina puru).b Te tātari FCS/FCCS o tetahi tauira o nga whakahiato αS/Tau441 motuhake i whiwhi mai i te LLPS (paepae maui).Ka whakaatuhia nga pihi Aunoa (AC) mo te AF488 me te Atto647N ki te puru me te whero, ka whakaatuhia nga pihi-whakawhitiwhiti (CC) e hono ana ki nga whakahiato kei roto nga tae e rua ka whakaatuhia ki te papura.Ko nga pihi AC e whakaatu ana i te noho mai o nga momo monomeric me nga momo pūmua whakahiato kua tapaina, engari ko nga pihi CC e whakaatu ana i te tohatoha noa o nga kohinga tapanga-rua.Ko te tātaritanga ano, engari i raro i nga ahuatanga otinga rite ki nga waahi taratahi, ko nga tauira kei roto anake te monomeric αS me te Tau441 ka whakaatuhia hei mana whakahaere i te paewhiri matau.c Te wetewete i te korikori o nga ngota ngota kotahi o nga whakahiato taratahi i hangaia i roto i nga coacervates hiko αS/Tau441.Ko nga korero mo ia whakahiato ka kitea i roto i nga tukurua rereke e wha (N = 152) ka whakatakotohia ki o raatau stoichiometry, uara S, me te pai o te FRET (te pae o runga, te pae tae e whakaatu ana i te puta).E toru nga momo whakahiato ka taea te wehewehe: -αS-anake nga whakahiato me S~1 me FRET~0, Tau-anae whakahiato me S~0 me FRET~1, me nga whakahiato Tau/αS me te takawaenga S me te FRET Nga whakatau tata o te nui o nga pūmua tohu e rua ka kitea i roto i ia whakahiato rereke (N = 100) ka whakaatuhia ki te papa o raro (ko te tauine tae e whakaatu ana i te putanga).Ka whakaratohia nga raraunga mata ki te ahua o nga konae raraunga mata.
Ko te maoatanga, te koroheketanga ranei o te pūmua wai ka huri ki roto i te ahua o te kaera, i nga hanganga totoka ranei i roto i te waa kua korerohia he maha nga mahi a-tinana o te condensate47 tae atu ki nga mate, he tukanga rereke i mua i te whakahiato amyloid 7, 48, 49. ka akohia e matou te wehenga o te waahanga me te whanonga.LSPT αS i te aroaro o nga polycations matapōkere i roto i te taiao e whakahaeretia ana i te iti o te micromolar kukū me nga tikanga e pa ana ki te tinana (kia mahara ko te kuhanga whaiaroaro o te αS he> 1 µM50), e whai ana i nga whanonga a te LPS i runga i te thermodynamically.I kitea e matou ko te αS, kei roto he rohe C-terminal tino kino ki te pH ahupūngao, ka kaha ki te hanga i nga rūpahu whai hua o te pūmua i roto i te wairewa wai ma te LLPS i te aroaro o nga peptides tino cationic disordered penei i te pLK, i te Tau ranei na roto i te tukanga o te electrostatic. condensation matatini i te aroaro o nga macromolecules whakahiato.Ka whai hua pea tenei tukanga i roto i te taiao pūkoro i reira ka tutaki a αS ki nga momo ngota ngota polycationic e pa ana ki tana whakahiatotanga e pa ana ki te mate i roto i te vitro me te vivo51,52,53,54.
I roto i te maha o nga rangahau, ko te tere o te pūmua i roto i nga rūrūtia kua kiia ko tetahi o nga take matua e whakatau ana i te tukanga pakeke55,56.I roto i te electrostatic αS coacervates ki polycations, te ahua o te tukanga matuatanga i runga i te kaha o te taunekeneke ki polycations, te valence, me te maha o enei taunekeneke.Ko te ariā taurite e kii ana ko te whenua taurite o nga whenua wai e rua ko te noho mai o te topata nui e whai kiko ana i nga koiora e peia ana te LLPS57,58.Ka taea te tipu o te maturuturutanga ma te Ostwald maturation59, coalescence60 me te kai o te monomer kore utu i te wahanga marara61.Mo te αS me te Tau441, te ΔNt-Tau, te pLK ranei, ko te nuinga o te pūmua i noho ki te condensate i raro i nga tikanga i whakamahia i roto i tenei rangahau.Heoi, ahakoa ka tere te whakakotahi o nga pata tau i runga i te makuku o te mata, he uaua te whakakotahitanga me te makuku he uaua mo te ΔNt-Tau me te pLK, e tohu ana he tere te ngaro o nga taonga wai i enei punaha e rua.E ai ki ta maatau tātaritanga FLIM-FRET, ko nga pata tawhito pLK me te ΔNt-Tau i whakaatu he rite te tohu o te whakahiato pūmua (he rite te ora o te fluorescence) ki nga maturuturutanga taketake, e kii ana i mau tonu te whatunga pūmua taketake, ahakoa he pakari ake.
Ka whakatauhia e matou o matou hua whakamatautau ki te tauira e whai ake nei (Whakaahua 8).Ko nga rūrūtia i hangaia mo te wa poto he maha nga whatunga pūmua kaore he utu hiko, na reira he waahi koretake o te utu, ina koa i te atanga topata, ka puta he rūrūtia me te kaha o te mata hiko.Hei utu mo te utu (he ahuatanga e kiia nei ko te whakahekenga valence) me te whakaiti i te kaha o te mata o nga rūrūtia, ka taea e nga rūrūtia te whakauru i nga polypeptides hou mai i te wahanga waimeha, te whakarite ano i nga whatunga pūmua ki te arotau i nga tauwhitinga utu-utu, me te taunekeneke ki etahi atu rūrūtia.me nga mata (makuku).Ko nga maturuturu o te αS/pLK, na te mea he maamaa ake o raatau whatunga pūmua (he taunekeneke heterotypic anake i waenga i te αS me te pLK) me te hononga nui ake mo te taunekeneke pūmua-poroteina, te ahua nei ka tere ake te whakataurite i te utu o te condensate;Inaa, i kite matou i te tere ake o nga kinetika pūmua i roto i nga kohinga αS/pLK i hanga tuatahi atu i te αS/Tau.Whai muri i te paheketanga o te valence, ka iti haere nga tauwhitinga, ka ngaro te wai o nga rūrūtia, ka huri ki te rite ki te rei, he topata kore mura me te iti o te hiko hiko o te mata (na reira kaore e taea te whakamakuku i te mata).He rereke, he iti ake te pai o nga pata αS/Tau ki te arotau i te toenga o te utu maturuturu na te uaua ake o nga hononga pūmua (me nga tauwhitinga homotypic me te heterotypic) me te ngoikore o nga taunekeneke pūmua.Ko te hua o tenei ko nga rūpahu ka pupuri i te whanonga wai mo te wa roa me te whakaatu i te kaha o te mata hiko e kaha ana ki te whakaiti ma te whakakotahi me te tipu (na reira ka whakaiti i te waahanga o te mata/rōrahi ōwehenga o nga rūrūtia) me te whakamakuku i te kemi mata hydrophilic.Ka hangaia he whare pukapuka pūmua nui e pupuri ana i te wai i te mea ka noho tonu nga taunekeneke na te rapu tonu mo te arotautanga utu i roto i te whatunga pūmua.He mea whakamere, ko nga momo Tau kua tapatapahia te mutunga-N, tae atu ki etahi isoforms62, e whakaatu ana i te whanonga takawaenga, me etahi ka whakaahuru me te αS ki roto i nga topata rea-roa, ko etahi ka huri ki roto i te wai nui.Ko tenei taaruatanga i roto i te maoatanga o te αS electrostatic coacervates e rite ana ki nga rangahau LLPS o naianei me nga rangahau whakamatautau kua kitea he hononga i waenga i te whakahekenga valence me te tatari hiko i roto i nga condensates hei matua ki te whakahaere i te rahi o te condensate me nga taonga wai.Hangahanga 58.61.
Ko tenei kaupapa e whakaatu ana i te huarahi whakahiato amyloid putative mo αS me Tau441 ma LLPS me LSPT.Me etahi atu rohe whai kiko anion (whero) me te cation-taonga (puru), ko te αS me te tau electrostatic coacervates me te pai o te valence he iti ake te kaha o te mata, na reira ka iti ake te whakakotahitanga, ka tere te koroheketanga.Ka tutuki te ahua o te reera kore-agglomerated..He tino pai tenei ahuatanga i roto i te keehi o te punaha αS/pLK na te mea he hononga teitei ake me te whatunga whakawhitiwhitinga takirua takirua ngawari, e taea ai te whakawhiti tere penei i te gel.Engari, ko nga rūrūtia me te valence kore e pai ana, na reira, ko nga rohe kua utaina ki te pūmua e waatea ana mo te taunekeneke, ka ngawari ake mo te coacervate ki te whakakotahi me te whakamakuku i te mata hydrophilic hei whakaiti i tona kaha teitei o te mata.He pai ake tenei ahuatanga mo nga coacervates αS/Tau441, he whatunga matatini maha kei roto i nga tauwhitinga ngoikore Tau-Tau me αS-Tau.Ka huri, ka kaha ake nga coacervates nui ake ki te pupuri i o raatau ahua rite ki te wai, ka taea e etahi atu taunekeneke pūmua-ki-poroti kia puta.I te mutunga, ko nga whakahiato heterogeneous amyloid kei roto i te αS me te tau kei roto i te wai coacervate, tera pea e pa ana ki nga mea e kitea ana i roto i nga tinana whakauru, he tohu o nga mate neurodegenerative.
Ko nga hanganga rite-wai-nui i hangaia i te wa o te maoatanga o te αS/Tau441 me te taiao pūmua tino pukumahi engari hihiri, me te iti ake, ko nga coacervates αS/ΔNt-Tau he puna pai mo te nucleation o te whakahiato pūmua.I tino kite matou i te hanganga o nga whakahiato pūmua totoka i roto i tenei momo coacervates pūmua, he maha nga wa kei roto te αS me te tau.Kua whakaatuhia e matou ko enei heteroaggregates e whakapumauhia ana e nga taunekeneke kore-hiko, e kaha ana ki te here i nga waikano ThT tauwhāiti-amyloid i roto i te huarahi rite ki nga fibrils amyloid angamaheni, a he rite tonu te parenga ki nga momo awe.Ko nga whakahiato αS/tau i hangaia e te LLPS i whakaatuhia he ahua amyloid.Inaa, ko te rerekee pakeke o te Tau he ngoikore ki te whakahiato amyloid he tino ngoikore i te hanganga o enei whakahiato αS heterogeneous i roto i te coacervate electrostatic wai.Ko te hanganga o nga whakahiato αS/Tau441 i kitea anake i roto i nga coacervates, i mau tonu nga ahuatanga wai-rite, a kaore rawa, mena kaore nga coacervates/droplets i tae ki te ahua o te reera.I roto i te keehi whakamutunga, ko te kaha ake o nga taunekeneke hiko, a, na te mea, na te pakari o te kupenga pūmua ka aukati i te whakarereketanga o nga pūmua e tika ana hei whakarite i nga taunekeneke pūmua hou e tika ana mo te nucleation amyloid.Heoi, ka taea tenei ki roto i nga coacervates ngawari ake, penei i te wai, ka kaha ake te noho wai i te mea ka piki ake te rahi.
Ko te mea he pai ake te hanga o nga whakahiato i roto i te wahanga whakapoapoa i roto i te αS/Tau condensates nui atu i nga rūrūtia iti e tere tere ana, e whakaatu ana i te whai take o te tautuhi i nga mea e whakahaere ana i te whakakotahitanga o te maturuturu.Na, ehara i te mea he ahua noa mo te wehenga o te wahanga, engari me whakahaere te rahi o te condensate mo te mahi tika me te aukati mate58,61.Ko o maatau hua e whakaatu ana i te hiranga o te toenga i waenga i te LLPS me te LSPT mo te punaha αS/Tau.Ahakoa ka taea e te hanga topatapata te whakamarumaru mai i te whakahiatotanga amyloid ma te whakaheke i te nui o nga monomers pūmua e waatea ana i raro i nga tikanga whakamaarama, pera i te whakaaro i etahi atu punaha63,64, ko te whakakotahitanga o te maturuturunga iho ki nga taumata topata teitei ka arahi pea ki te whakahiato pūmua o roto ma te puhoi o te whakarereketanga o te hanganga.whatunga pūmua..
I roto i te katoa, ko o maatau raraunga e tino whakanui ana i te whai take o te hononga honohono me nga taunekeneke makona / kore i pai i roto i nga whatunga maturuturu i roto i te horopaki o te LSPT.Ina koa, e whakaatu ana matou ka taea e nga condensates αS/Tau441 te roa-katoa te whakakotahi me te karihi ki te hanga i nga heteroaggregates rite-amyloid e uru ana ki nga pūmua e rua me te whakatakoto tikanga irapoi i runga i o maatau hua whakamatautau.Ko te whakahiatotanga o nga pūmua e rua i roto i te αS/Tau fluid coacervate e korerotia ana e matou i konei he pono pea he hononga ki te whakaurunga o nga pūmua e rua i roto i nga whakaurunga, he tohu tohu o te mate, a ka whai waahi ki te mohio ki te hononga i waenga i te LLPS me te whakahiato amyloid, te para i te huarahi mo te IDP tino utu i roto i te neurodegeneration.
Monomeric WT-αS, cysteine ​​​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) me nga momo ΔCt-αS (Δ101-140) i whakaatuhia i roto i te E. coli me te purea pera i te korero i mua.Ko te 5 mM DTT i whakauruhia ki roto i nga waahanga katoa o te purenga o te αS cysteine ​​​​mutants hei aukati i te hanganga here disulfide.Tau441 isoform (plasmid i whiwhi mai i Addgene #16316), ΔNt-Tau momo (Δ1–150, i whiwhi i te cloning IVA me nga primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) me te AggDef-Tau rereke me te 3ΔTC275 te momo ahurea kua purea. i tipu ki te OD600 = 0.6-0.7 i te 37°C me te 180 rpm, me te whakapuaki i te IPTG mo te 3 haora i te 37°C.Kohikohi nga pūtau ki te 11,500 xg mo te 15 meneti i te 4 °C ka horoi ki te waipara tote kei roto te 150 mM NaCl.Whakaorangia te pire i roto i te lysis buffer (20 ml ia 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 100).Ko te taahiraa sonication i mahia i runga i te hukapapa me te kaha kaha o te 80% mo te 10 nga pupuhi (1 meneti i runga, 1 meneti atu).Kaua e neke ake i te 60 ml i roto i te ultrasound kotahi.I whakamahanahia nga E. coli lysates i te 95° C. mo te 20 meneti, ka whakamatao ki runga tio, ka centrifuge i te 127,000×g mo te 40 meneti.I tonohia te supernatant whakamarama ki te kiriuhi 3.5 kDa (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) me te whakamaarama ki te 4 L o te parepare dialysis (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2mM , PMSF 0.1 mM) mo nga haora 10.Ko te 5 ml cation exchange column (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) i rite ki te parepare whakarite (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) .I tātarihia te tau lysate i roto i te tātari 0.22 μm PVDF ka werohia ki roto i te pou i te tere rere o te 1 ml / min.I āta mahia te whakangao, i whakaemihia te tau ki te 15–30% te parepare elution (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).I wetewetehia nga hautau e te SDS-PAGE, a, ko nga hautau kei roto i te roopu kotahi me te taumahatanga ngota e tumanakohia ana o te tau i whakakorikoria ma te whakamahi i te tātari centrifuge 10 kDa, ka whakakapia ki te parepare he 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM me DTT 2 mM mo ko te kukū pūmua whakamutunga ko 100 μM.Ka tukuna te otinga pūmua i roto i te tātari 0.22 μm PVDF, ka tere toka ka rongoa ki te -80°C.Ko te Protein K18 i atawhaitia e Prof. Alberto Boffi.Ko te ma o te whakarite he> 95% i whakapumautia e SDS-PAGE me MALDI-TOF/TOF.He maha nga momo cysteine ​​i tohu matū ki te AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) TEMPOL-maleimide ranei (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).i whakapumautia e te whakauru me te MALDI-TOF/TOF.Ko Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau me K18 i tapaina ki nga toenga cysteine ​​​​maori i nga waahi 191 me 322 ma te whakamahi i te Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Tiamana) e whai ana i taua tikanga.Ko te utu kupenga mo ia mahere toenga mo αS me Tau441 i hangaia ma te whakamahi i te CIDER66.
Ko te poly-L-lysine totoka (pLK DP 90-110 e ai ki te NMR mai i te kaiwhakarato, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) i rewa i roto i te 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 ki te 10 mM kukū, te tukanga sonicated mo 5 meneti i roto i te pati wai ultrasonic ka rongoa ki te -20°C.Ko te PEG-8, te dextran-70, te FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) me te FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) he wairewa te wai me te tohatoha whanui i roto i te LLPS buffer.Ka whakakorehia e te whakaheke toto nga tote poke.I muri mai ka tātarihia na roto i te tātari syringe me te rahi o te pore o te 0.22 μm, a ka tatauhia o raatau ma te whakamahi i te refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).I whakaritea nga tauira LLPS i te pāmahana rūma i roto i te raupapa e whai ake nei: i konatunatuahia te parapara me te tangohanga me te 1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) me te ranunga o te 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Katahi ka taapirihia te αS me nga polycations whakakotahi (kowhiringa pLK, Tau ranei).Mo nga whakamatautau raupapa taima thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), whakamahia te kohinga ThT katoa hei haurua o te kukume αS.Whakaranuhia marietia nga tauira kia rite tonu.He rereke te kukume o ia waahanga mai i te whakamatautau ki te whakamatautau, pera i te korero i te waahanga Hua.I whakamahia te Azide i te kukū o te 0.02% (w/v) i nga wa katoa ka neke ake te roanga o te whakamatautau i te 4 haora.Mo nga tātaritanga katoa e whakamahi ana i nga tauira LLPS, tukua te ranunga kia rite mo te 5 meneti i mua i te tātaritanga.Mo te tātari marara marama, 150 µl o nga tauira i utaina ki runga i nga pereti moroiti 96-puna kore here (µClear®, pango, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) ka hipoki ki te kiriata whakapiri.I aroturukihia nga LLP ma te ine i te whakauru i te 350 nm i te pokapū o te otinga i roto i te panui pereti CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Germany).I mahia nga whakamatautau i roto i te taarua i te 25°C, a ko nga hapa i kiia ko te ine rereke mai i te toharite.Ko te wahanga waimeha i inehia e te tauira centrifugation me te SDS-PAGE wetewete reera, a ko te hautanga αS i roto i nga wahanga waimeha me nga waahanga kua tohua i roto i nga momo otinga LLPS.He tauira 100 μl LLPS kei roto 1 μM AF488-tapanga αS i whakaritea ma te tino ranu ka whai i te centrifugation i te 9600×g mo te 30 meneti, i muri iho ka kitea te rerenga.Ko te 50 μl runga o te supernatant i whakamahia mo te inenga pūmua ma te whakamahi i te gel SDS-PAGE.I karapahia nga kaera me nga whiriwhiringa AF488 ma te whakamahi i te punaha whakaahua reera ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ka pania ranei ki te paru Coomassie ka whakaatahia me nga whiriwhiringa tika.I tātarihia nga roopu hua ma te whakamahi i te putanga ImageJ 1.53i (National Institutes of Health, USA).I mahia nga whakamatautau ki te taarua i roto i nga whakamatautau rereke e rua me nga hua rite.
I te nuinga o te waa, 150 μl o nga tauira i whakamahia ki nga microplates 96-pai kaore i herea, ka kitea i te pāmahana rūma i runga i te miihini hurihuri Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).Mo nga whakamatautau waahi, i whakamahia ano nga pereti µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) ranei 96-well polystyrene microplates (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).I whakamahia nga rama halogen EL6000 me te mercury metal halide hei puna whakamarama (mo te whakaahua BF/DIC me te WF).Mo te moroiti WF, he 40x te whakanui i te whaainga rangi (Leica Microsystems, Tiamana) i whakamahia ki te arotahi i te rama ki te tauira me te kohikohi.Mo nga tauira AF488 me te ThT kua tapaina, tātarihia te whakaihiihi me te tukunga me nga huinga tātari GFP paerewa, te hihiko me nga tātari bandpass tuku, 460-500 nm me te 512-542 nm nga whiriwhiringa bandpass, me te whakaata dichroic 495 nm.Mo nga tauira kua tapaina ki te Atto647N, he huinga paerewa o nga whiriwhiringa Cy5 me te whakaihiihi me te tuku i nga whiriwhiringa bandpass 628-40 nm me te 692-40 nm, me te 660 nm dichroic whakaata i whakamahia.Mo te moroiti BF me te DIC, whakamahia te kaupapa kohinga rama whakaata.Ko te rama kua kohia i tuhia ki te kamera Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Germany).Ko te wa whakamohiotanga ko te 50 ms mo te whakaahua miihini BF me te DIC me te 20-100 ms mo te whakaahua miihini WF.Hei whakataurite, ko te wa whakakitenga mo nga whakamatautau katoa me te ThT he 100 ms.I mahia nga whakamatautau taima ki te whakaata i te whakakotahitanga o te maturuturunga iho, me nga whakaahua ka kohia ia 100 ms mo etahi meneti.I whakamahia te ImageJ (NIH, USA) mo te tātari whakaahua.I mahia nga whakamatautau i roto i nga taarua me nga hua rite.
Mo nga whakamatautau korokoro, FRAP me te hanga 3D, i riro mai nga whakaahua i runga i te Zeiss LSM 880 inverted confocal microscope ma te whakamahi i te ZEN 2 puru putanga (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).Ko nga tauira o te 50 µl i tukuna ki nga riu µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germany), i tukinotia ki te polymer hydrophilic (ibiTreat) me te whakanoho ki roto i te kaupapa 63× hinu rumaki (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) i runga DIC).I riro mai nga whakaahua ma te whakamahi i te 458 nm, 488 nm, me te 633 nm nga raina laser argon me te taumira o te 0.26 µm / pika me te wa whakamaarama o te 8 µs / pika mo te whakahihiri me nga matapihi kitenga o te 470-600 nm, 493-628 nm, me te 638–755 nm i whakamahia hei whakaata i a ThT, AF488 me Atto647N.Mo nga whakamatautau FRAP, i tuhia nga whakaahua poto mo ia tauira ki te 1 anga mo ia hekona.I mahia nga whakamatautau i roto i te taarua i te pāmahana rūma me nga hua rite.I tātarihia nga whakaahua katoa ma te whakamahi i te rorohiko Zen 2 puru (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).Ko nga pihinga FRAP he mea whakarite, he whakatakoto me te whakauru ki nga raraunga kaha/wa i tangohia mai i nga whakaahua ma te whakamahi i te Zen 2 ma te whakamahi i te OriginPro 9.1.I whakauruhia nga pihi whakaora ki tetahi tauira tauputanga kotahi hei whakaatu mo te whakamaaramatanga rapoi me tetahi atu kupu taupuke hei whakaatu mo te paanga whakahiatotanga.Na ka tatauhia e matou te D ma te whakamahi i te radius bleaching ingoa me te haurua-ora i whakatauhia i mua ake nei penei i te wharite o Kang et al.5 35 kua whakaatuhia.
Ko nga momo cystineine kotahi o αS i whakahiatohia me te 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) i nga waahi 24 (TEMPOL-24-αS) me 122 (TEMPOL-122-αS), ia.Tapanga Hurihuri Mo nga whakamatautau EPR, i whakaritea te kukū αS ki te 100 μM me te kukū PEG ko 15% (w/v).Mo nga ahuatanga whakahiato, ko te αS:pLK ōwehenga he 1:10, ko te αS:ΔNt-Tau me te αS:Tau441 i mau tonu ki te 1:1.Mo nga whakamatautau titration here i te kore o te tini, ka mau tonu a TEMPOL-122-αS ki te 50 μM me nga polycations i titrated i te piki haere o te kuhanga, me te whakarite takitahi i ia ahuatanga.I mahia nga inenga CW-EPR ma te whakamahi i te Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer me te Bruker ER4118 SPT-N1 resonator e mahi ana i te ngaruiti (SHF) auau o ~9.7 GHz.I whakaritea te mahana ki te 25°C ka whakahaeretia e te hauota cryostat wai.I whiwhihia te hiihini i raro i nga tikanga haunga i te mana MW o te 4 mW, te kaha tiwerawera o te 0.1 mT, me te auau whakarereke o te 100 kHz.I whakaritea te kaha o te moohio ki te karo i te rerekeetanga o nga kuhanga miro i waenga i nga tauira me te heke o te miro na te toenga o te toenga o nga matū whakaheke i roto i nga tauira kei roto te Tau441 me te ΔNt-Tau (kei roto i nga otinga pūmua taketake).Ko nga uara o te g i whakawhiwhia mai i te whakatauira EPR spectral i mahia ma te whakamahi i te punaha Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) i whakatinanahia i Matlab®67.Kotahi/e rua nga waahanga tauira isotropic i whakamahia hei whakatauira i nga raraunga.Whai muri i te whakataurite i nga tohu katoa, ka tatauhia nga toenga ma te tango i ia whaihanga mai i te awhiowhio whakamatautau e rite ana.Mo te tātari titration here, ka whakamahia te kaha o te roopu tuatoru ki te roopu tuarua o te awhiowhio EPR (IIII/III) hei aroturuki i te herenga o nga polycations ki te αS.Hei whakatau tata i te taumau wehewehenga (Kd), i whakauruhia te anau ka puta ki tetahi tauira tata ki te whakaaro n nga waahi herenga orite me te motuhake.
I mahia nga whakamatautau hihinga NMR ma te whakamahi i te Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spectrometer me te cryoprobe me te Z-gradient.I mahia nga whakamatautau katoa ma te whakamahi i te 130-207 µM αS me te αS/ΔNt-Tau me te pLK rite ki te 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ka mahia i te 15°C.Hei aroturuki i te LPS ma te NMR, 10% PEG i tapirihia ki nga tauira i mua i te whakauru.Ko te matū whakakorikori matū (Fig. 1b) e whakaatu ana i te toharite nekehanga matū 1H me 15N.Ko te αS 2D1H-15N HSQC spectra i tohua i runga i te mahi o mua (BMRB entry #25227) me te whakapumau ma te tuhi me te tātari i te 3D spectra o HNCA, HNCO me CBCAcoNH.Ko te 13Cα me te 13Cβ nga nekehanga matū i tatauhia i te aroaro o te ΔNt-Tau, pLK ranei hei ine i nga huringa ka taea i roto i nga ahuatanga o te hanganga tuarua i whakaritea ki nga nekehanga matū αS i roto i te ahua o te porohita matapōkere 68 (Whakaahua 5c).I inehia nga reiti R1ρ ma te tuhi i nga whakamatautau hsqctretf3gpsi (i whiwhi mai i te whare pukapuka Bruker) me te roa o te 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, me te 800 ms, me nga mahi taupū i whakatikahia ki te roanga o te kaha o te teitei. nga wa ki te whakatau i te R1ρ me te koretake o te whakamatautau.
I mahia nga whakamatautau moroiti rewharewha kua whakatauhia e rua-tae i runga i te karu karu korikori MT200 (PicoQuant, Berlin, Tiamana) me te taputapu tatau whakaahua kotahi (TCSPC).Ka whakamahia te upoko diode taiaho mo te whakakorikori i roto i te whakakorikori (PIE), ka haere te kurupae i roto i te aratau aratau ngaru kotahi, ka anga ki te mana taiaho o 10 ki te 100 nW mo te 481 nm me te 637 nm nga raina laser i whanganga i muri i te whakaata dichroic.Ma tenei ka whakarite i te reeti tatau whakaahua whakaahua tino pai, ka karo i nga paanga o te whakaahua whakaahua, te whakamaarama whakaahua me te waatea.μ-Slide angiogenesis coverslips or plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) i tuu tika ki roto i te wai rumaki i runga i te Super Apochromat 60x NA 1.2 arotahi me te kara whakatika (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Ko te whakaata 488/640 nm dichroic (Semrock, Lake Forest, IL, USA) i whakamahia hei wehenga kurupae matua.Ka aukatihia te iraruke kore e arohia e te kohao me te diameter o te 50 microns, katahi ka wehea te iraruke arotahi ki nga ara rapu e 2 e te wehenga kurupae 50/50.Ko nga whiriwhiringa tukunga Bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 mo te tae kaakaariki (AF488) me te 690/70 mo te tae whero (Atto647N) i whakamahia i mua o te kaitirotiro.Ko nga diodes avalanche kotahi-photon (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italy) i whakamahia hei kaitirotiro.Ko nga kohinga raraunga me te tātari i mahia ma te whakamahi i te rorohiko SymphoTime64 e waatea ana ki te hokohoko (PicoQuant GmbH, Berlin, Tiamana).
E rima tekau nga microliters o nga tauira LLPS i whakamahia ki nga puna angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany).Ko nga whakaahua ka puta ka arotahi ki te 20 µm i runga ake i te puna puna mo te tawhiti mahi tino pai mo nga rūrūtia kua whakatarewatia me te ~1 µm mo nga rafts me nga ira me te taumira axial o te 0.25 µm/pika neke atu me te wa roa o te 400 µs/pika.Tīpakohia te raraunga ma te whakamahi i te paepae kaha i runga i te kaha o te tohu papamuri toharite (PBG, mean + 2σ) mo ia hongere kia kowhiria ai nga rūpahu pūmua wai, rafts, potiki ranei, me te tātari i nga takenga mai i te wahanga marara.Hei tātari i te roanga o te oranga o ia momo (τ) o ia hongere (matomato, “g” mo te AF488 me te whero, “r” mo Atto647N), i tohua e matou nga rohe paanga (ROI) kei roto nga rūrūtia, nga rafts, nga waahi ranei (Whakaahua 1. ).8b) ka puta mai ma te whakauru i te pirau o te oranga (τD, τR me te τP mo nga rūrūtia, moti, mokowhiti ranei, tirohia te Tāpiritanga Fig. 8c) i roto i ia hongere ma te whakamahi i te tātaritanga hiku me te tauira pirau-wahanga e rua.Toharite τ mai i te τ .Ko nga ROI i whakaputa he iti rawa nga whakaahua mo te whakaurunga-maha-nui i kapea mai i te tātaritanga.Ko te tapahi i whakamahia he <104 whakaahua mo nga raft me nga ira me te 103 mo nga topata.He iti ake te paepae o nga rūrūtia na te mea he uaua ki te whiwhi i nga pihi pirau me nga uara kaha teitei ake, i te mea he iti ake, he iti ake te maha o nga rūrūtia i te mara atahanga.Ko nga ROI me nga tatau whakaahua kei runga ake i te tepe whakaemi whakaahua (whakaturia ki te >500 tatau/pika) i makahia mo te tātari.Whakatauritehia te pihinga pirau i puta mai i te rohe whai paanga me te kaha ki te 90% o te morahi (i muri iho i te tino kaha o te pirau) mai i te timatanga o te oranga o te mahi kia iti ai te wawaotanga IRF i te wa e mau tonu ana mo te paunga kaha katoa. Tautuhinga Matapihi wa patata I tātarihia 25 ki te 50 ROI mo nga rafts me nga waahi me te 15-25 ROI mo nga maturuturu, ko nga whakaahua i tohua mai i te neke atu i te 4 nga taapiri i tuhia mai i te iti rawa 3 nga whakamatautau motuhake.Kua whakamahia nga whakamatautau-t-rua hei arotake i nga rereketanga tatauranga i waenga i nga momo, i waenga ranei i nga punaha coacervate.Mo te tātaritanga pika-a-pika mo te roanga o te ora (τ), i tatauhia te tapeketanga o te oranga i runga i te mara mo ia hongere, ka mahia he tata o te tauira whakahekenga tauputanga 2/3-waahanga.Ko te whakahekenga ora mo ia pika ka whakauruhia ma te whakamahi i nga uara τ kua tatauhia i mua, ka puta he ahua pseudocolor FLIM pai.He rite tonu te awhe mo te hiku o te ora ki runga i nga whakaahua katoa o te hongere kotahi, a ko ia pirau ka whakaputa i te nui o nga whakaahua kia pai ai te tika.Mo te tātaritanga FRET, i kowhiria nga pika ma te whakamahi i te paepae kaha iti o te 100 whakaahua, he tohu tohu papamuri (FBG) 11 whakaahua.Ko te kaha o te rere o ia hongere i whakatikahia e nga waahanga whakatikatika i whakatauhia e te whakamatautau: 69 spectral crosstalk α he 0.004, he 0.0305 te whakaihiihi tika, he 0.517 te kaha o te kitenga γ.Ko te kaha o te FRET i te taumata pika ka tatauhia ma te whakamahi i te wharite e whai ake nei:
i reira ko te FDD te kaha o te rewharewha e kitea ana i roto i te hongere kaituku (matomato), ko te FDA ko te kaha o te rewharewha e kitea ana i roto i te hongere whakaae (whero) i raro i te whakaihiihi autaki, a ko te FAA ko te kaha o te rewharewha e kitea ana i roto i te hongere kaikawe (whero) i raro i te whakaihiihi tika ( PIE).Ka kitea nga pupuhi kaha o te rewharewha i te hongere).
Whakanohoia te 100 µl o nga otinga tauhohenga LLPS kei roto te 25 µM monomeric Tau441 (me te kore ranei 25 µM αS) ki roto i te kaitapa LLPS (kua taapirihia i runga ake nei) ki runga i nga pereti moroiti 96-puna kore here me te paninga konumohe piri me te hanga pata i tirohia i muri i te kape o te moroiti WF. whakaōrite.i roto i te 10 min.I muri i nga haora 48 o te heki i te pāmahana rūma, ka whakapumautia te aroaro o nga raiti pūmua me nga waahi.Kātahi ka āta tango i te wai i runga i ngā mōkihi mai i ngā puna, kātahi ka tāpirihia te 50 rita o te parepare whakawehe (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ka whakamakuku mo te 10 meneti.Ko te tote nui o te tote ka whakarite kia kore te LLPS e tukurua na te toenga o te PEG, a ka wetewetehia nga huinga pūmua ka hangaia e nga tauwhitinga hiko.Katahi ka ata waruhia te raro o te puna ki te pito micropipette ka whakawhitia te otinga o te wairewa ki te puna mataki kau.I muri i te incubation o nga tauira me te 50 μM ThT mo te 1 h, ka tirohia te aroaro o nga waahi taratahi e te WF microscopy.Whakapaia nga fibrils αS sonicated ma te incubating 300 µl o te otinga 70-µM αS i roto i te PBS me te pH 7.4, te konutai azide 0.01% i te 37 °C me te 200 rpm i runga i te wiri orbital mo nga ra e 7.Ko te otinga ka centrifuged i te 9600 × g mo te 30 min, ka tukuna ano te pire i roto i te PBS pH 7.4 me te sonicated (1 min, 50% huringa, 80% amplitude i roto i te Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) tauira fibril. he rite tonu te tohatoha rahi o nga muka iti.
Ko te tātaritanga FCS/FCCS me te kitenga ohorere e rua-tae (TCCD) i mahia i runga i te MT200 te wa-whakaoti karu karu (Pico-Quant, Berlin, Tiamana) i whakamahia mo nga whakamatautau miihini FLIM-FRET ma te whakamahi i te aratau PIE.Ko te mana laser mo enei whakamatautau i tapirihia ki te 6.0 µW (481 nm) me te 6.2 µW (637 nm).Ko te huinga o enei mana laser i whiriwhiria hei whakaputa i te kanapa rite mo nga takirua o nga fluorophores i whakamahia i te wa e eke ana nga reeti tatau tino pai me te karo i te whakamaarama whakaahua me te waatea.I mahia e rua nga kohinga raraunga me te tātari ma te whakamahi i te rorohiko SymphoTime64 putanga 2.3 (PicoQuant, Berlin, Tiamana).
Ko nga tauira o nga whakahiato αS/Tau taratahi ka whiwhi ma te whakamahi i te LLPS ka waimeha i roto i te parepare wehe ki te kukū monomolecular e tika ana (te tikanga he waimeha 1:500, i te mea kei te iti noa nga whakahiato ina wehea mai i nga tauira coacervate).Ko nga tauira i tukuna tika ki nga kapi (Corning, USA) kua pania ki te otinga BSA i te kukū o te 1 mg/mL.
Mo te tātaritanga PIE-smFRET i roto i nga hongere kaakaariki me te whero, he iti ake te paepae kaha o te 25 whakaahua ki te tarai i nga tohu kaha iti i puta mai i nga huihuinga monomeric (me mohio he nui ake te maha o nga monomers i nga tauira whakahiato ka whakatauritea ki nga whakahiato motuhake).I tatauhia tenei paepae e rima nga wa o te kaha toharite o te αS monomeric i puta mai i te tātaritanga o nga tauira monomer parakore kia taea ai te whiriwhiri i nga whakahiato hei tātari.Ko te ara iahiko puku PIE, me te tango raraunga TSCPC, kua taea te whakamahi i te tātari taumahatanga mo te ora e awhina ana ki te whakakore i te papamuri me te korero whakawhiti matakite.Ko te kaha o te mura i tohua ma te whakamahi i nga paepae o runga ake nei i whakatikahia ma te whakamahi i te tohu papamuri toharite i whakatauhia mai i nga histograms o te takanga me te kaha/puera o nga tauira parepare-anake.Ko nga pakaru e hono ana ki nga whakahiato nui ka noho ki te maha o nga ipu karapīpiti i roto i te tohu wa (whakaturia ki te 1 ms).I roto i enei take, i whiriwhiria he ipu kaha morahi.Mo te tātaritanga FRET me te stoichiometric, i whakamahia te tauwehe gamma γ (0.517) i whakatauhia.Ko te whakawhitiwhiti korero me nga takoha whakahihiri tika he iti noa (kua whakatauhia ma te whakamatautau) i te mana taiaho whakahihiri i whakamahia.Ko te kaha me te stoichiometry o te FRET i roto i te pahūtanga ka tatauhia penei.