347 he kowiri tira whakakikoruatia te wahanga matū ngongo ,Tautuhinga o nga pūmua chaperone leukocyte antigen-A (HLA-A) hou e whakautu ana i te tangata interferon e whakamahi ana ma te whakamahi i te whiti-hono-whakawhitinga papatipu spectrometry (CLMS)

Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Kei te whakamahi koe i tetahi putanga tirotiro me te tautoko CSS iti.Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tua atu, hei whakarite i te tautoko tonu, ka whakaatuhia e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Rēreti e whakaatu ana i nga tuhinga e toru mo ia kiriata.Whakamahia te patene o muri me te taha o muri hei nuku i roto i nga kiriata, ko nga paatene mana kiriata kei te pito ki te neke ma ia kiriata.

Whakaahuatanga Hua

Kowiri tira 347L ngongo Coil, Koeke maitai: SS347L

Ko te punaha tohu interferon e whakaohooho ana i te urupare cytokine kaha ki te whanuitanga o nga tohu pathological pathogenic me te intrinsic mai i te taiao, ka puta mai i te whakauru o nga waahanga o nga pūmua interferon-inducible.I tono matou i te DSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) ki te kite i nga tauwhitinga pūmua-pūmua hou i roto i te rohe o nga pūmua-a-interferon.I tua atu i nga puiao interferon-inducible e tumanakohia ana, i tautuhia ano e matou nga taapiri-whakawhitinga-whakawhitinga-whakawhitinga-whakawhitinga-a-roto-a-roto o nga pūmua interferon-inducible canonical penei i te MX1, USP18, OAS3, me STAT1.I arotahi matou ki te whakamanatanga orthogonal o te huinga pukapuka o nga hononga pūmua interferon-inducible i hangaia e nga pūmua HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ma te whakamahi i te co-immunoprecipitation me a raatau rangahau ano ma te whakamahi i te tauira hihiko rapoi.Ko te whakatauiratanga o te whakanekeneke o te whakahiato pūmua i whakaatu i te maha o nga waahi taunekeneke e whakaata ana i nga taunekeneke i kitea i roto i nga kitenga CLMS.Ka whakaatuhia he rangahau pairati mo te CLMS ki te tautuhi i nga matatini tohu hou na te interferon, me te titiro whakamua ki te whakamahinga whanui o CLMS ki te tautuhi i nga hihiko hou o nga taunekeneke pūmua i roto i te taiao moroiti puku.
I mua i te tiimatanga o te urupare mate urutau, ka whakairihia e te punaha tiaki a-roto o te kaihautu he urupare antimicrobial i takawaenga e te whanau o nga cytokine alpha-helical huna e kiia nei he interferon (IFNs).Ko te momo I IFN akomanga IFNα me IFNβ ka whakahohe i nga urupare waea, tae atu ki nga ahuatanga antiviral, proapoptotic, proinflammatory, me te antiproliferative.I roto i te tangata, e 13 nga momo iti o te IFNα e mohiotia ana, kua kohia katoa ki runga i te chromosome 91. He mea whakamiharo, ko IFNα2 anake i akohia mo te whakamahinga haumanu.I tata nei, kua aro nui ki te rangahau mo etahi atu momo iti o IFNα.I whakaatuhia e tetahi rangahau tata nei ko IFNα14 tetahi o nga isoforms tino whai hua ki te aukati i te tukuruatanga o te HBV2 me te HIV-13,4 i whakaritea ki te momo-iti IFNα2 canonical.
Kua whakatauhia ko te momo I whakahoahohia nga whakahiato kaiawhina interferon (IFNAR1 me IFNAR2) ka whakaoho i te riima whakawhiti tohu i waenga i a Janus kinases TYK2 me JAK15,6.Ko enei Janus kinases phosphorylate tohu transducers me transcriptional pūmua activators (STAT1 me STAT2) i runga i te toenga tyrosine ki te kōkiri SH2 rohe-takawaenga heterodimerization6.I muri mai, ka herea e IRF9 nga heterodimers STAT ki te hanga i te matatini trimeric o te IFN-stimulated factor 3 ira (ISGF3), e whakawhiti ana ki te karihi me te whakakorikori i te tuhi o runga i te 2000 interferon-stimulated genes (ISGs)5,6,7,8.
Ko nga ISG te tuara o te punaha raupatu tuuturu, ina koa ki te whakautu ki te whakaeke viral.Hei rarangi arai tuatahi ki te mate huaketo, ka tere te hora o nga pūtau i nga taunekeneke whanui o nga pūmua pūtau me te whānuitanga o nga mahi koiora.Ko enei pūmua kei roto i nga kaiwhakawhiwhi tohu tohu, nga ngota ngota tohu, nga take tuhi, me nga pūmua whai mahi patu huaketo tika, tae atu ki nga kaiwhakahaere kino o nga urupare mate9.Ko te nuinga o nga korero mo te ngohe ISG ka puta mai i nga mata mahi ma te whakamahi i nga mata overexpression10,11 me nga tikanga whakangau ira (siRNA, RNAi me CRISPR)12,13 e whakaatuhia ana, e aukatihia ana ranei nga ISG takitahi me te whakamatautau i o raatau mahi ki nga momo wheori.Ahakoa kua whakatauhia e enei rangahau nga ahuatanga pareketo o nga ISG takitahi, ko nga tikanga ngota ngota o ia ISG kaore i te mohiotia.E whakaaetia ana he maha nga pūmua e pahekoheko ana me te kotahi, neke atu ranei o nga cytokines hei whakarite i te mahi katoa, na reira ka mahi tika nga ISG, ka takawaenga ranei o raatau taunekeneke e nga pūmua pūtau.Hei tauira, he rangahau proteomic hono-whakaahua tata nei i tautuhia ko ATPase VCP/p97 he hoa tauwhitinga IFITM3 nui, ko tana aukati e arai ana ki nga hapa i roto i te tohatoha lysosomal, te hurihanga, me te whakawhiti tahi o te IFITM3 me nga matūriki viral 14.Ma te whakamahi i te immunoprecipitation, i tautuhia e matou te VAPA, he pūmua e pa ana ki te vesicle, hei hoa tauwhitinga me te IFITM1/2/3 e takawaenga ana i te matuatanga o te mate o te cholesterol-takawaenga, a, i whakapumautia tenei e tetahi atu rangahau ma te whakamahi i te punaha rewena rua-hybrid.Tautoko Putaiao 15 , 16 .
Ko tetahi tukanga koiora taketake e whai waahi ana ki te aukati i te mate me te huringa kino ko te whakaaturanga antigen, he mea takawaenga e nga ngota ngota ngota ngota tino hitocompatibility complex (MHC).Ko nga Peptides (8-12 waikawa amino te roa) mai i nga pūmua kua mawehea, kua mutu wawe, kua pohehe ranei ka utaina ki roto i te MHC-I heterodimer (kei roto i nga mekameka MHC-I taumaha me te marama, e kiia ana ko β-2-microglobulin; β2M) 17,18.Ko nga hua o te MHC-I trimers ka haria ki te mata o te pūtau, kei reira ka whakaatuhia nga peptides intracellular ki nga pūtau CD8+ T (cytotoxic T cells)17.E mohio ana, e whakangaro ana nga pūtau T i enei tukumate me nga pūtau e mau ana i te antigen motuhake mo te puku.No reira, he maha nga wa ka pehia e nga pathogens me nga pūtau puku te tukanga whakaaturanga antigen hei karo i te tirotiro aukati.I tua atu, ka whakahekehia te MHC-I i roto i te 40-90% o nga pukupuku o te tangata, a, he maha nga wa e pa ana ki te mate kino rawa atu19.
Ko nga ira e uru ana ki te urupare ki nga tukumate me tere te huri i waenga i te waahi okiokinga me te ahua o te tuhi kaha.Na reira, he maha nga pūmua pūtau e whakaarohia ana ka uru ki te urupare ki te tono IFN nui mo nga wa poto, tae atu ki te whakahou me te whakarereketanga o te kaiwhakatairanga chromatin 20,21.Ko te nuinga o nga rangahau e arotahi ana ki te tautuhi i nga hoa pūmua ISG takitahi i te aroaro o te IFN.He maha nga rangahau proteomic me te transcriptomic i roto i nga punaha pūtau tauira kua whakamarama i te paanga o te IFN ki runga i te whenua pūkoro.Heoi, ahakoa te piki haere o te maarama ki nga hihiritanga e whakaawehia ana e nga interferon, he iti tonu te mohio mo te whakaurunga o nga ISG.I te wa e whakaarohia ana te uaua me te kaha-waa o te tohu interferon, e rua nga patai ka puta: (i) ka taea te whakapumau me te mahanga i nga matatini multiprotein e uru ana ki te tohu tere, a (ii) ka taea te mapi enei taunekeneke ki te waahi 3D?
Hei whakatika i enei take, i whakatinanahia e matou te succinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) i honoa me te mass spectrometry (CLMS) ki te ako i te whatunga taunekeneke pūmua a IFNα me ona hihiri.Ka taapirihia e te DSS nga here kovalent i waenga i nga toenga tata o nga pūmua me/ranei nga matatini pūmua i roto i te vivo.Ko te tātaritanga MS o muri ka whakaatu i nga waahi honohono motuhake e whakaata ana i te tata mokowā o nga rohe i roto i tetahi pūmua, e kiia ana ko nga hononga o roto, he waahanga iti ranei i roto i nga huinga pūmua, e kiia ana ko te hononga.Ma te whakamahi i tenei huarahi, kua tautuhia e matou he maha o nga kohinga pūmua-poroti hou tae atu ki nga whatunga taunekeneke multiprotein-induced interferon.Ma te whakamatautau ano i tetahi waahanga o enei taunekeneke hou, ka whakaatuhia e matou ko te H2BFS (H2B histone-momo FS; i muri nei ka kiia ko H2B) me MDN1 hei hoa here mo HLA-A.
Ko nga pūtau Flo-1 tetahi o nga tauira in vitro tino rongonui o te adenocarcinoma esophageal i te mea ka peehia e ratou nga ahuatanga matua o nga pukupuku esophageal22,23.Engari, ehara i te mea he immunogenic nga pukupuku katoa, a ki te whakatau mena ka whakautu nga pūtau Flo-1 ki te maimoatanga interferon, i rongoatia e matou nga pūtau Flo-1 me te 10 ng/ml IFNα mo te 72 haora.I whakaatuhia e nga ruma Flo-1 te whakauru wawe o te pSTAT1 me te IRF1, ka timata i nga haora 2 i muri i te maimoatanga me te haere tonu mo nga haora 72, me te heke o te wa i nga taumata tuuturu o IRF1 (Whakaahua 1A).Ko nga ISG (MX1, IFITM1, OAS1 / 2, me te ISG15) i kitea he kaha te akiaki i muri i nga haora 6, ka peehia nga urupare o waenga me te mutunga o te waahanga ki te IFNα (Whakaahua 1A).Ko enei raraunga e kii ana ka taea te whakamahi i tenei tauira pūkoro ki te ako i nga urupare interferon.
Ko nga whakautu korero pūmua rereke i roto i nga ruma Flo-1 i muri i te maimoatanga IFNα.(A) Ko te whakaputanga pūmua i roto i nga pūtau Flo-1 i tukuna ki te 10 ng/ml IFNα mo te 2, 6, 24, 48 me te 72 haora i tātarihia e te immunoblot ma te whakamahi i nga antibodies ISG kua tohua.(B) Coomassie puru SDS-PAGE he kara o nga tangohanga pūtau katoa i muri i te hono-whakawhitinga ki te DSS mo nga wa kua tohuhia me te kukume.(C) I tirotirohia te mate immunoblot me te p53(DO-1) antibody mai i nga tauira rite ki te aromatawai i te tohu o te hononga-whakawhitinga pūmua.
Ki te hopu i te whenua tauwhitinga pūmua i roto i te waahi, i whakamahia e matou te DSS, he kaihoko hono-whakawhitinga nui e whakamahia ana na te nui o te uruhanga kiriuhi me te wa poto.Ko te wa tauhohenga poto ka awhina ki te aukati i te hanganga o nga whakahiato nui o nga pūmua honohono, na reira ka mau tonu te pumau o te hononga whakawhiti.Hei whakatau i te kukū DSS tino pai me te karo i te hono-whakawhitiwhiti, i te tuatahi ka whakaatuhia e matou nga pūtau ki te 5, 2.5, me te 1 mM DSS mo nga meneti 5, 10, 5, me te 30, ka tirotirohia nga lysates na Coomassie-stained SDS-PAGE (karekau nga raraunga i whakaatuhia).Ko nga lysates pūtau he tino hono-whakawhitinga i te iti rawa o te kukū me te wa poto rawa atu.No reira, i titrated te DSS ki te 1, 0.5, me te 0.1 mM mo te 5 meneti (Whakaahua 1B).I kitea te hononga whakawhiti tino pai ki te 0.5 mM DSS mo nga meneti 5, a ko enei tikanga i whiriwhiria mo nga pūtau e rongoa ana me te IFNα.I tua atu, ko te Whakaatu 1C e whakaatu ana i te parani o te Tai Hauauru i mahia ma te whakamahi i te p53 (DO-1) antibody hei aromatawai i te tohu o te hononga whakawhiti pūmua.
I tukinotia nga ruma Flo-1 ki te 10 ng/ml IFNα mo nga haora 24 i mua i te taapiri i te hononga whakawhiti.Ko nga pūtau hono-whakawhitinga i muri mai ka lysedhia e te proteolysis e rua-taahiraa me nga pūmua i tukatukahia e te FASP (Fig. 2)24,25.I tātarihia nga peptides tryptic hono-whiti e te spectrometry papatipu (Fig. 2).Ka tauritehia te hiranga MS/MS ki te raupapa pūmua me te ine ki te MaxQuant26,27.Ko nga peptides hono-whakawhitinga i kitea mai i te hiranga i whiwhi ma te whakamahi i te kaupapa SIM-XL, a ka whakakotahihia nga puhui takitahi ki roto i te whatunga matatini ma te whakamahi i te xQuest28 me te SIM-XL29 tuwhera puna rorohiko rorohiko pipelines (Fig. 2).Ka tautuhia e SIM-XL nga taunekeneke pūmua-pūmua, nga mekameka o roto me nga mekameka takitahi i roto i nga ranunga pūmua ngawari, uaua ranei, me te whakarato i nga tuhinga mo te whakaata i nga taunekeneke i roto i nga hanganga pūmua.I tua atu, ka whakatauhia ia tohutoro-whakawhiti hei tohu ID e ai ki te kounga o te hiiwhiorangi MS/MS29.He maha nga tauwhitinga pūmua-pūmua tino pono kua tautuhia, a kua rangahaua ano he huinga tauwhitinga hou ma te whakamahi i te co-immunoprecipitation me te whakarereketanga o nga matatini ma te whakatauira i te hihiko rapoi (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Tirohanga tirohanga mo te tikanga CLMS.I tukinotia nga pūtau Flo-1 ki te 10 ng/ml IFNα mo nga haora 24 ka whai i te hononga-whakawhitinga pūmua in situ ma te whakamahi i te DSS ka whai i te lysis pūtau me te trypsinization.I tātarihia nga tauira hono-whakawhiti ma te whakamahi i te Orbitrap mass spectrometer me te tauira ano mo te wehewehenga o nga peptide precursors i te wa LC-MS/MS.E rua nga peptides hono i tautuhia mai i te hianga i whiwhi ma te whakamahi i te Miihini Whakaaetanga Spectrum o te kaupapa Crosslinked Peptides (SIM-XL), a ka honoa nga pūhui katoa ki roto i te whatunga matatini ma te whakamahi i nga pipeline rorohiko.Tātarihia ngā pāhekoheko māia iti i runga i ngā kaute reeti pai (FDR).He maha nga hononga hou o te pūmua-pūmua hou i whakapumauhia ma te whakamahi i te co-immunoprecipitation, me nga huringa conformational i roto i nga matatini i tirotirohia ma te whakamahi i te tauira molecular dynamics (MD).
Ko te katoa o ~ 30,500 me ~ 28,500 peptides i kitea ma te whakamahi i te MaxQuant i roto i nga tauira IFNα kaore i whakaihiihihia me te whakaihiihi, ia (Taapiri taapiri S1, Fig. 3A).Ko te tohatoha roa o te peptide i roto i nga waahanga e rua i whakaatu i te waahanga nui ake o nga peptides nui ake, e tohu ana i te aroaro o nga peptides hono-whiti (Fig. 3B, C).I tua atu, he nui ake te waahanga o nga peptides nui i roto i te awhe 40-55 i roto i nga tauira IFNα-tukinotia (Fig. 3C).Ko te mahere pūmua ki te kaha o te log2 i whakaatu ko nga pūmua whakaihiihi-interferon matarohia te nui rawa atu i whakaritea ki nga tauira kaore i mahia, tae atu ki te MX1, IFIT1 / 3, OAS2 / 3, DDX58, me te HLA-F (Whakaahua 3D).Ko te tātaritanga o nga huarahi mo nga pūmua neke atu i te toru nga wa i whakarangatirahia i roto i te whakautu ki te maimoatanga IFNα ma te whakamahi i te reactome pathway database i whakaatu ko MHC-I-mediated antigen whakaaturanga me te tukatuka ko te huarahi tino nui (Whakaahua 3E).I rite ki nga purongo o mua, ko nga urupare antiviral i takawaenga e OAS me ISG15 tae atu ki te IFNα / β me te tohu cytokine i roto i nga huarahi kua whakahohehia.I tua atu, ko te lysine- me te serine-specific protein cross-links i tautuhia mai i te MS / MS spectra i whiwhi tuatahi ma te whakamahi i te SIM-XL.I puta he rangahau tata nei 104 nga ISG e 20 nga wheori mai i nga karaehe huaketo e 9 na roto i te tātari-meta o nga rangahau mo te whakaputanga ake ISG takitahi i roto i nga momo pūtau e 59.Heoi, ki te hinga i nga herenga rorohiko o te tirotiro i nga huingararaunga nui, i timata matou me te huingararaunga iti ake ki te tuhura i nga taunekeneke ka taea i waenga i te rarangi o nga ira IRDS i ripoatahia e Padaria et al., ko te nuinga he ISG.
Ko te tautuhi i nga porotini honohono-whakawhitinga rereke hei whakautu ki te IFNα (nga raraunga i whiwhi mai i MaxQuant).(A) Hoahoa Venn e tohu ana i te maha o nga peptides noa me te motuhake i tautuhia i roto i nga tauira Flo-1 IFNα14 i tukinotia, kaore ano kia rongoatia.Te tohatoha roa o te Peptide o nga tauira hono-whakawhitinga (B) me te IFNα i tukinotia (C).(D) Mapi wera e tohu ana i te roko2 (te kaha LFQ) i waenga i nga pūtau Flo-1 kare i rongoatia me te IFNα14.Ko te papa maui e whakaatu ana i nga pūmua e tino kaha ana te mahi i te aroaro o IFNα.(E) Histogram e tohu ana i nga huarahi whakarangatira nui e 20 i muri i te maimoatanga IFNα.I tātarihia e te pātengi raraunga ara Reactome neke atu i te wha nga huringa i roto i nga pūmua whakautu IFNα-whakaaro.
He pai te tuhi i te whakaihiihi ISG i waenga i te Interferon, engari i te taumata ngota kare i te tino maarama me pehea te mutunga o enei pūmua i roto i te whānuitanga o nga mahi koiora.I tirotirohia e matou nga taunekeneke pūmua me te tino maia i waenga i nga ISG e mohiotia ana.Ko te ahuareka, i tautuhia e matou he whatunga tae atu ki te MX1, USP18, ROBO1, OAS3, me STAT1 pūmua e hanga ana i te matatini nui hei whakautu ki te maimoatanga IFNα (Whakaahua 4, Ripanga S2) 32,33,34.Ko te mea nui, ko enei taunekeneke i kitea i roto i nga taarua toru katoa i tukuna ki te IFNα, a, kaore i kitea i roto i nga tauira kaore i tukuna, e kii ana i hangaia hei whakautu mo te maimoatanga IFNα.E mohiotia ana ko te STAT1 te whakamaoritanga i nga korero o enei ISG, engari ko tana taunekeneke me nga ISG i te taumata pūmua kaore i akohia.Ko te hanganga karaihe o STAT1 i whakaatu ko tana rohe helical (CCD) kaore e uru ki te taunekeneke me te DNA me nga protomers i te wa o te hanganga o te dimers35.Ka hangaia e enei α-helices he hanganga helical helix e whakarato ana i te nuinga o te mata o te mata hydrophilic mo nga tauwhitinga ka puta 35 .I roto i o maatau korero CLMS, i kite matou ko te nuinga o nga taunekeneke me STAT1 i puta i te rohe SH2 i mua i te CCD, te rohe hono, te hiku C-terminal ranei (te toenga 700-708) (Whakaahua 4A).Ko tetahi rangahau o mua i kii ko te USP18 e herea ana ki te rohe CCD me te DNA-binding (DBD) o STAT2 ka whakauruhia ki te waahanga o te momo I interferon receptor IFNAR2 hei takawaenga i te aukati o te momo I interferon tohu 24.I whakaatu ano o maatau raraunga ko te rohe catalytic USP18 e taunekeneke ana me STAT1 DBD (Whakaahua 4A, D), e kii ana ka whai waahi nga STAT1 me STAT2 ki te kukume i te USP18 ki IFNAR2.
Ko te whatunga ISG pūmua-pūmua i tautuhia i roto i nga pūtau hono-whakawhiti kua rongoatia me te IFNα.(A) Mahinga tauwhitiwhiti 2D e whakaatu ana i nga taunekeneke pūmua-pūmua (he mea hanga i roto i te kaupapa SIM-XL), me nga raina e tohu ana i nga taunekeneke intermolecular (crosslink cutoff set to 3.5).Ko nga waahi o nga tuakiri rereke ka tohua e o raatau tae32: rohe MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), me GED (569–660).Nga rohe OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), me OAS1_C (903-108).Rohe ROBO1, Ig_3 (67–151), I-huinga (170–258), I-huinga (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) me fn3 (777–864).Ngā āpure STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), me STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Kaitiro porowhita o nga pūmua hono-whakawhiti (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, me STAT1) me nga taunekeneke me nga tauwhitinga kua tapaina ki te puru me te whero.Ko te paepae hononga-whakawhitinga i whakaritea ki te 3.5.Ko nga tohu ira e tohu ana i nga waahi taunekeneke STAT1 me MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), me OAS3 (F), me nga waahi taunekeneke K, S ranei i waenga i nga peptides e rua.I roto i te ahua, kua whakaritea te paepae kaute-whakawhiti ki te 3.0.(G) He maha nga waahi whakawhitiwhitinga i waenga i nga rohe STAT1 me OAS3 DI kua whakakikoruatia ki runga i o raatau hanganga pūmua i roto i te PyMol (PyMOL molecular graphics system, version 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) me OAS3 (pdb id: 4s3n34).) hōtaka.
E rua nga momo ahua o te USP18 kua whakaahuahia i roto i te tangata, he pūmua-roa te nuinga kei roto i te karihi, me te isoform kaore he rohe N-terminal, USP18-sf, e tohatoha ana i roto i te cytoplasm me te nucleus 36 .I tua atu, ko te N-terminus i tohuhia kaore i hangaia, kaore e hiahiatia he mahi isopeptidase, he here ISG1537 ranei.Ko te nuinga o nga tauwhitinga kua tautuhia i roto i ta maatau rangahau kei te N-terminus o te pūmua, e kii ana ko enei taunekeneke ka uru ki te USP18 roa (Whakaahua 4A, D) ka puta pea i roto i te karihi.I tua atu, ko o maatau raraunga e tohu ana ko te N-terminus he mea motuhake mo nga taunekeneke pūmua-ki-pmua.Ko te waahi here IFNAR2 kei waenganui i nga toenga 312-368, me te mea nui, kaore tetahi o nga pūmua i roto i te matatini e hono ana ki tenei rohe (Fig. 4A) 37,38.Ko enei raraunga i kohia e tohu ana ko te rohe herenga IFNAR2 e whakamahia ana e te pūmua kaiwhakawhiwhi.I tua atu, ko te OAS3 me te ROBO1 anake i kitea e hono ana ki nga rohe ki runga ake o te waahi herenga N-terminus me te IFNAR2 (Whakaahua 4A).
Ko te ROBO1 no te immunoglobulin (Ig) superfamily o nga ngota ngota tohu transmembrane, e rima nga rohe Ig me nga rohe fibronectin (Fn) e toru i roto i te rohe extracellular.Ko enei rohe extracellular e whai ana i te rohe membrane-proximal me te helix transmembrane kotahi 39. Kei te C-terminus tetahi rohe intracellular kaore i hangaia, kei roto hoki nga kaupapa raupapa kua tiakina e takawaenga ana i te herenga pūmua effector39.Ko te rohe mai i nga waikawa amino ~ 1100 ki te 1600 kei te tino raruraru.I kitea e matou ko te MX1 te taunekeneke me te ROBO1 na roto i te Ig, Fn, me nga rohe intracellular, ko te nuinga o nga taunekeneke me STAT1 ka puta i waenga i tana CCD, te rohe hono, me te C-terminus o ROBO1 (Fig. 4A, E).I tetahi atu taha, ko nga taunekeneke me nga rohe hono DI, DIII, me OAS3 i tohatoha puta noa i te ROBO1 protein (Fig. 4A).
Ko te whanau pūmua oligoadenylate synthase (OAS) e whakaae ana, e here ana i te RNA (dsRNA) i roto i te pūkoro, ka huri i nga whakarereketanga, ka whakahiato i nga oligoadenylates hono 2′,5′ (2-5 As) 40 .I kitea i roto i nga OAS e toru, ko te OAS3 e whakaatu ana i te tino hononga mo te dsRNA me te synthesizes te iti rawa o te 2-5 As, ka taea te whakahohe i te RNase L me te whakaiti i te tukurua viral 41.Kei roto i te whanau OAS nga polymerase beta (pol-β)-rite nga rohe whakawhiti nucleotide.Ko nga rangahau o mua kua whakaatuhia ko te mahi catalytic o te rohe C-terminal (DIII) kei te whakawhirinaki ki te rohe here-dsRNA (DI), e hiahiatia ana mo te whakahohe i te OAS342.I kite matou ko nga rohe DI me DII o OAS3 e mahi tahi ana me te CCD me tetahi rohe hononga iti i waenga i te SH2 me te STAT1 TAD (Whakaahua 4A, F).Ko te whakakikorua i nga waahi whakawhiti rereke i runga i te hanganga pūmua i kitea he taunekeneke i waenga i te β-sheet me te DBD STAT1 loop me te pute tuwhera, te rua ranei i hangaia e nga toenga 60-75 i te rohe DI o OAS3 (Fig. 4G).Ko te whakatakotoranga o nga pūmua i roto i te matatini i tohu hoki kaore tetahi o nga taunekeneke me te OAS3 i pokanoa ki te kaha o te here DNA o tona rohe DI (Fig. S1A).I tua atu, ko te rohe N-terminal o GTPase MX1 he nui te taunekeneke ki nga rohe DI me DIII o OAS3 (Fig. 4A).I kite ano matou i te taunekeneke i waenga i te OAS1 me te MX1 i roto i nga mahi tukurua IFNα e toru, i te waahi o te rohe OAS1 kotahi (he kaha te kaha o te mahi) me nga rohe MX1 e toru (Whakaahua S2A,B).
Ko nga pūmua MX he wahanga o te whanau nui o nga GTPase rite ki te dynein kei roto he rohe N-terminal GTPase e herea ana, e whakawaiwai ana i te GTP, he rohe takawaenga hei takawaenga i te whakahiato-whaiaro, me te kumemau C-terminal leucine e mahi ana hei GTPase (LZ). ).rohe pānga rohe25,43.Ka herea te MX1 ki nga waahanga iti o nga polymerases viral hei aukati i te tuhi o te ira viral43.I whakaatuhia e te mata o te rewena e rua-hybrid i mua ake nei ko te MX1 e hono ana ki te PIAS1 ka aukati i te whakahohenga ira a STAT1-takawaenga ma te aukati i te mahi here DNA me te whai SUMO E344,45 mahi ligase.I konei, ka whakaatuhia e matou ko te MX1 e herea ana ki te STAT1 (Whakaahua 4C, D), engari me pehea te paanga o tenei taunekeneke ki te whakahohenga ira a STAT1 hei whakautu ki a IFNα me rangahau ano.I tua atu, i kitea ano e matou ko MX1 te taunekeneke me te IFIT3 me te DDX60 i roto i nga waahanga e toru kua tukinotia e te IFNα (Fig. S2C).
Ko te DDX60 he helicase cytoplasmic i whakaawehia e te IFN kua korerohia i mua ki te whai waahi ki te RIG-I-motuhake o te RNA46 viral.Ka mahi tahi me te RIG-I me te whakahohe i tana tohu tohu i roto i te momo ligand-specific 46. Kei roto i te DDX60 te rohe helicase DEXD / H-Box me te rohe helicase C-terminal e herea ana te RNA viral me te DNA47.Ko te nuinga o ana taunekeneke ki te MX1 me te IFIT3 ka puta i roto i nga rohe roa N- me C-terminal kaore he rohe kanoona, he kaupapa ranei (Fig. S2E,F).Engari, ko te MX1 ano hoki e hono ana ki te rohe DEXD / H-Box helicase (Fig. S2E).Ko nga pūmua o te whanau IFIT he kape taurite o te kaupapa helix-turn-helix motuhake e kiia nei ko te tetrapeptide repeat (TPR).I kitea te IFIT3 he pai te whakarereketanga o te tohu RIG-I, na reira he waahanga o te matatini MAVS.Ka huihuia, ko o maatau korero e kii ana ko te IFIT3 me te DDX60 te taunekeneke tuatahi i roto i te rohe i waenga i te TPR 3-6 o IFIT3 me te whai waahi ki te tohu RIG-I / MAVS (Fig. S2F).
I te mea ko te tirotiro i te katoa o te poroteome he kaha ki te taraihia, katahi ka tirotirohia e matou te katoa o te patengi raraunga UniProt tangata mo te noho mai o tetahi o nga tukuruatanga IFNα.I roto i tenei tauira, i kitea e matou etahi hononga tauwhitinga tino pono mo HLA-A.Ko te tātaritanga o nga huarahi pūmua i tautuhia e te MS/MS spectra i whakaatu ko te MHC-I-based antigen tukatuka me te whakaaturanga ko te huarahi matua i whakaawehia e te interferon (Fig. 3D).Na reira, i arotahi matou ki te ako i nga taunekeneke pūmua o nga ngota MHC-I me te nui o te maia ki nga tauira honohono katoa.Kei roto i te HLA nga rohe α1, α2 me α3 me nga mekameka marama, me te microglobulin β2 (β2m) he pūmua chaperone tonu49.Kia huihuia ki roto i te reticulum endoplasmic, karekau te HLA i te kore o te peptide ligands50.Ko te riu peptide-binding e hangaia ana e te tino polymorphic me te kore hanganga α1 me te α2 rohe i roto i te ahua kore-peptide me te rohe polymorphic α351 tino iti.I te aroaro o te IFNα, i kitea e matou nga huinga HLA-A e rua: ka uru tetahi ki te HMGA1 me te H2B (Whakaahua 5, Ripanga S3) me etahi atu e mahi tahi ana me MDN1, LRCH4 me H2B (Whakaahua 6).
Ko te IFNα te whakauru i te whatunga whakawhitiwhiti HLA-A me te H2B (H2BFS) me te HMGA1.(A) Mahinga 2D (i hangaia i roto i te rorohiko SIM-XL) e whakaatu ana i nga momo taunekeneke rereke i roto i te matatini H2B-HLA-A-HMGA1: te hono (puru), te hononga (whero) me te hono kotahi (pango)..Ko nga waahi o nga taangata rereke he tohu tae32: H2B (histone; 2–102) me MHC-I (MHC_1; 25–203, roopu C1; 210–290 me MHC_I_C; 337–364).Ko te paepae hono-whakawhitinga i whakaritea ki te 3.5.Ko nga tohu ira e tohu ana i nga waahi taunekeneke HLA-A me te H2B (B) me te HMGA1 (C), me nga waahi taunekeneke K, S ranei i waenga i nga peptides e rua.I roto i te ahua, kua whakaritea te paepae kaute-whakawhiti ki te 3.0.(D) Ko nga hononga i waenga i nga pūmua e whakaatuhia ana i roto i nga hanganga o te H2B, HLA-A, me te HMGA1 pūmua i roto i te kaupapa PyMOL.I whakatauirahia enei hanganga ma te whakamahi i te tūmau Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) me nga hanganga tauira mo te H2B, HLA-A me HMGA1 pūmua he 1kx552, 1kj349 me 2eze55.
Ko te IFNα te whakauru i te whatunga whakawhitiwhiti HLA-A me H2B (H2BFS), MDN1 me LRCH4.(A) Intramolecular (whero) me te intermolecular (puru) hononga whakawhiti kua whakaatuhia ki runga i te mapi tauwhitiwhiti 2D (i hangaia i roto i te rorohiko SIM-XL) me te MDN1 e tohuhia ana hei porowhita.Ko te paepae hono-whakawhitinga i whakaritea ki te 3.5.Ko nga waahi o nga momo tuakiri he tohu tae32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, roopu C1; 210–290 me MHC_I_C; 337–364) me LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) me CH (535–641)).(B) Nga hononga i waenga i nga pūmua e whakaatuhia ana i roto i nga hanganga o te H2B, HLA-A, LRCH4, me te MDN1 pūmua i roto i te kaupapa PyMOL.I whakatauirahia enei hanganga ma te whakamahi i te tūmau Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) me nga hanganga tauira 1kx552, 1kj349, 6hlu62 me 6i2665 mo nga pūmua H2B, HLA-A, LRCH4 me MDN1, ia.Mahinga ira e whakaatu ana i nga waahi taunekeneke K, S ranei mo HLA-A me H2B (C), LRCH4 (D), me MDN1 (E).Mo nga waahi, i whakaritea te paepae kaute-whakawhiti ki te 3.0.
I tua atu i te pupuri i te pono o te genome, ka uru ano te histone H2B ki te whakahaere i te tuhi.Ko te pūmua H2B he rohe histone pokapū (HFD) i hangaia e nga α-helices e toru i wehea e nga koropiko me te hiku C-terminal 41,52.Ko te nuinga o te taunekeneke ki te H2B ka puta i roto i te α1 helix, e whakarato ana i te trimerization ki te HFD heterodimer (Fig. 5A, B).Ahakoa kei te whai waahi nga lysins ki te here DNA, ko etahi lysins he waahi acetylation, methylation ranei.Hei tauira, ko nga toenga K43, K46, me te K57 mai i te H2B kaore e uru ki te herenga DNA tika, engari he whainga mo nga momo whakarereketanga i muri i te whakawhiti53.Waihoki, ko nga toenga K44, K47, me te K57 i roto i te H2B ka taea te mahi rereke i te aroaro o te IFNα, tae atu ki nga taunekeneke me etahi atu pūmua (Fig. 5A, B).I tua atu, ka whakahohehia e te H2B histone extrachromosomal te urupare aukati i roto i nga momo momo pūtau, ka mahi hei pukoro cytosolic ki te kite i nga whatiwhatinga DNA (dsDNA) taurua i ahu mai i nga kaihoko hopuhopu, nga pūtau pakaru ranei54.I te aroaro o nga huaketo DNA, ko te whakahekenga o te H2B i aukati i te hanga IFN-β me te STAT154 phosphorylation.Ko te H2B e mohiotia ana he tere ake te neke ki roto, ki waho o te karihi i era atu histones matua54.Ko nga taunekeneke H2B me te MDN1 me te LRCH4 i kitea ano i roto i nga tauira kaore i tohua.I kitea e matou ko te HLA-A i mahi tahi me te H2B i roto i nga tauira e toru kua tukinotia e te IFNα me tetahi tauira tukurua kaore ano kia rongoatia.Ko enei raraunga e whakaatu ana i te mahi a te H2B i roto i tetahi atu mahi whaiaroaro motuhake i runga i te ture tuhi.
Ko te HMGA1 (te roopu nekeneke teitei AT-Hook 1), he nucleoprotein iti e whai kiko ana ki nga waikawa amino whakatairanga mate, kua tohua i roto i te hononga ki te HLA-A.He hiku C-terminal waikawa me nga DBD motuhake e toru e kiia ana he matau AT no te mea ka herea ki te riu iti o te rohe taonga AT i roto i te dsDNA55,56.Ma tenei herenga ka piko, ka whakatika ranei te DNA, ka taea e nga ahuatanga o te tuhinga tuhinga te uru ki tana raupapa whakaaetanga.Ko te hiku C-terminal e whakaponohia ana ka uru ki roto i nga taunekeneke pūmua-pūmua me te whakauru i nga take tuhi, na te mea kaore e taea e nga mutants whakakore C-terminal te timata te tuhi57.I tua atu, kei roto i tenei rohe etahi waahi phosphorylation kua tiakina e mohiotia ana he taputapu mo nga kinase 58.I kite matou i nga taunekeneke a te HLA-A me te H2B me te HMGA1 i waho o te rohe C-terminal, e kii ana ko te rohe C-terminal te nuinga o te whakamahi mo te herenga tauwehe whakawhiti (Fig. 5A, C).Ka whakataetae nga pūmua HMGA ki te histone H1 mo te here ki te urutau DNA, na reira ka piki ake te uru57.Waihoki, ko te ahua pea kei te taunekeneke a HMGA me te histone H2B i te taha o te hononga DNA i te whakataetae me te histone H1.Ko te HMGB1 te whakauru i te korero o te HLA-A, -B, me te -C i roto i nga pūtau dendritic, e arai ana ki to ratou whakahohe59, engari ko te taunekeneke i waenga i te HMG me te HLA kaore ano kia korerotia i mua.I kitea e matou ko te HMGA1 e mahi tahi ana me nga rohe α1 me α3 o HLA-A, me te nuinga o nga whakawhitinga i waho o tana 3 DBD (Whakaahua 5A, C).I roto i o maatau ringaringa, i kitea te HLA-A ki te waahi i roto i te karihi (kaore i whakaatuhia nga raraunga), me te mea ko te H2B me te HMGA1 kei roto ano i te karihi, ka puta pea tenei taunekeneke i roto i te karihi.Ko nga taapiri motuhake i whanganga i waenga i te H2B, HLA-A, me te HMGA1 e whakaatuhia ana i te Whakaahua 5D.
Ko te nuinga o nga taunekeneke o te HLA-A me etahi atu pūmua ka puta i roto i ona rohe α1 me α2 me te rohe C-terminal raruraru (Fig. 6).I roto i tetahi o enei tauira, i kitea e matou ko te HLA-A te taunekeneke me te hiku N-terminal o te LRCH4 (Whakaahua 6A, D).Ka whakahaerehia e LRCH4 te whakahohenga TLR4 me te whakauru o te cytokine LPS, na reira ka whakarereke i te urupare mate mate60,61.He pūmua membrane me te e iwa nga reanga hou o te leucine (LRRs) me te kaupapa homology calmodulin (CH) i roto i tana ectodomain, ka whai i te rohe whakawhiti (TMD) 60, 62.Kua korerotia nga rohe CH ki te takawaenga i nga taunekeneke pūmua-pūmua 60.Tata ki te 300 nga waikawa amino i waenga i nga rohe LRR me CH e waatea ana engari he raru.I runga i te mahi o nga rohe raruraru hei takawaenga o nga hononga pūmua-pūmua me te kawe vesicular 63, i kitea e matou ko te nuinga o nga taunekeneke pūmua ka puta i nga rohe raruraru.Ko nga taunekeneke me te MDN1 i tohatohahia puta noa i te roa o te pūmua, tae atu ki nga rohe LRR1, LRR6, CH, me nga rohe matapōkere, ko te H2B te nuinga o te here ki te rohe CH (Fig. 6A, B).Ko te mea nui, kaore tetahi o nga taunekeneke i uru ki te TMJ, e whakaatu ana i te motuhake o te huarahi CLMS (Whakaahua 6A, B).
Kua tohua ano te MDN1 hei waahanga o te whatunga pūmua HLA-A (Whakaahua 6A).No te whanau AAA o nga pūmua (ATPases e hono ana ki nga mahi rereke).Koinei te rohe N-terminal AAA ano e whakarite ana ki te mowhiti hexameric me te tango i te tauwehe huihuinga mai i te 60S 64 ribosomal subunit.he rite ki te dynein64,65,66.I tua atu, ko te rohe whai rawa o Asp/Glu e whai ana i te rohe MIDAS (pae ti'aturi katote whakarewa).Na te nui o te MDN1 (tata ki te 5600 waikawa amino) me te iti o te homology me nga pūmua kua tino akohia, he iti te mohio mo tona hanganga me te mahi i roto i te tangata.I tautuhia e matou ko HLA-A, H2B, me LRCH4 he hoa hono MDN1 me te whakaatu i to raatau ahuatanga hei huinga pūmua i PyMol (Fig. 6A,B).Ko enei pūmua e toru ka pahekoheko ki te rohe AAA, te rohe hono rite-dynein, me te rohe MIDAS MDN1 pea.I roto i te rīpoata o mua, ko te purenga hononga o nga pūmua maunu i tohu ko MDN1 he pūmua e hono ana ki te histone H2B67.I tua atu, i puta ano he rangahau tata nei he taunekeneke i waenga i te MDN me te HLA-B i roto i nga pūtau HCT116 e whakamahi ana i te affinity-purified mass spectrometry, e tautoko ana i o maatau kitenga68.Ko te tohu o tenei matatini i roto i nga tauira IFNα-whakaritea he tohu mo te MDN1 i roto i te tohu interferon.
Na te mea he tino polymorphic nga ira HLA, i tangohia e matou nga panui raupapa maapeta HLA-A, -B, me -C mai i nga raraunga raupapa RNA o nga pūtau Flo-1 (kaore nga raraunga i whakaatuhia).Ko nga raupapa peptide e rite ana ki te panui raupapa i whakaatu i nga rereketanga nui i waenga i te HLA-A, -B, me te -C i nga rohe kei reira nga peptides hono-whiti i roto i te HLA-A (Whakaahua S3).I tua atu, karekau matou i kite i te honohono-whakawhitinga o te pūmua-ki-pūmua o te ngota ngota HLA-B/C me te pūmua H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.E tohu ana tenei ko te taunekeneke pūmua i kitea i waenga i te HLA-A, MDN1, LRCH1 me HMGA1 he HLA-A motuhake.I tua atu, ko te tātaritanga proteomic o nga tauira kore-whakawhitiwhiti (Ripanga S4) i whakaatu ko te HLA-A he nui ake te waahanga raupapa i whakaritea ki te HLA-B, ki te HLA-C ranei.Ko nga peptides kua tautuhia mo te HLA-A he nui te kaha i roto i nga tauira e rua i tukuna e te IFNα me nga tauira kore.
Hei whakarite ko nga tauwhitinga kua tohua i konei ehara i te mea na te honohono-kore-motuhake o nga pūmua e rua i roto i te tata mokowā, i whakapumautia ano e matou nga ahuatanga hou e rua o te HLA-A ma te mahi i nga whakamatautau-immunoprecipitation.Ko nga taunekeneke a te HLA-A me te MDN1 me te H2B endogenous i kitea i roto i nga ruma Flo-1 e rua i tukinotia e IFNα me te kore e rongoa (Whakaahua 7, Whakaahua S4).I whakapumautia e matou ko te HLA-A i mauhia e te H2B i roto i nga immunoprecipitates me tenei hononga na te maimoatanga IFNα mai i te ngaro o te HLA-A i roto i nga tauira immunoprecipitate mai i nga pūtau kaore i mahia (Whakaahua 7A).Heoi, ko o maatau korero e kii ana ko te IFNα he rereke te whakahaere i te HLA-A ki te H2B me te MDN1.Ko te IFNα te whakauru i te hononga i waenga i te H2B me te HLA-A, engari ka whakaiti i tana hononga ki te MDN1.I kitea e matou ko te MDN1 e hono ana ki te HLA-A i roto i nga mana whakahaere, me te taapiri o te IFNα i whakaitihia tenei taunekeneke motuhake mai i te whakauru MDN1 na IFNα (Whakaahua 7B, C).I tua atu, ka mau te HLA-A immunoprecipitation i te H2B i roto i nga ruma A549 (Fig. S4), e kii ana ko tenei taunekeneke he mea motuhake i te momo pūtau.Ka huihuia, ka tautoko enei hua i nga taunekeneke interferon-mediated o HLA-A me H2B me MDN1.
Ko te HLA-A ka purea tahi te H2B me te MDN1.Ko nga immunoblots o te H2B (A) me te MDN1 (B) nga mate o te mate i whakakorehia mai i nga pūtau Flo-1 e tukinotia ana e IFNα me te tirotirohia mo nga paturopi kua tohua.Ko te kiore me te rapeti IgG i whakamahia hei mana kino.(C) Ko nga rahinga (whakauru) o nga momo antigens rereke e whakaatuhia ana e nga immunoblots i tirotirohia ki nga antibodies kua tohua, i whakamahia te β-actin hei mana uta.
I tirotirohia nga ahuatanga o te hanganga o tetahi o nga hononga honohono-whakawhitinga-a-interferon, H2B-HLA-A-HMGA1.I whakamahia e matou te whakatauira o te hihiko ngota hei huarahi rereke kia mohio ai matou ki te whakakorikori o nga pūmua kei roto i tenei matatini (Whakaahua 8).Ko nga tohu mai i nga raraunga CLMS e whakaatu ana te ahua o nga ahuatanga rereke o nga pūmua H2B, HLA-A, me HMGA1.Na reira, i whakatauirahia nga matatini e whai ake nei i roto i te reo whakarewa: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, me H2B-HLA-A-HMGA1.Ko te mata tauranga pūmua-pūmua tuatahi e whakamahi ana i te MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montréal, Quebec, Canada) i whakaatu nga ritenga ka taea te rereke i waenga i enei pūmua (Fig. 8A).Ko te whakakitenga o te matatini pūmua tauranga i kitea he maha nga taunekeneke me nga ahuatanga ka taea (Whakaahua 5A, 8).No reira, kotahi te ahua o te ahua ka whakaatuhia ki te Whakaahua 8A (me nga hononga-whakawhitinga kua tapaina) ka arotakea ano ma te whakamahi i te paipa whakatauira MD.I tua atu, ko te herenga o te H2B ranei HMGA1 ki te HLA-A e whakaatu ana i te hononga teitei o te H2B mo te HLA-A (Fig. 8A).
Ko nga hihiko o nga hononga ka taea i waenga i nga huinga H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, me H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Ko te taha maui he mapi 2D (i hangaia i roto i te rorohiko SIM-XL) o nga hononga-a-roto-a-roto (whero) me nga hononga-a-waewae (puru) (kua whakaritea te tapahi hononga ki te 3.5).I tua atu, ko nga toenga honohono kua tautuhia kua tohua ki runga i nga hanganga o te H2B, HLA-A, me te HMGA1 pūmua.Ko nga ahuatanga o enei pūmua i tangohia ma te whakamahi i te paipa u ki roto i te kete MOE.Kei te taha maui o raro e whakaatu ana i nga ahuatanga rereke o te H2B-HLA-A me te HMGA1-HLA-A he rereke nga hononga here pūmua-pūmua (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Ine ine (RMSD) o nga tuunga ngota (kaore i te ngota hauwai) mo ia hanganga pūmua.(C) Intermolecular pūmua-pūmua hauwai tauwhitinga herenga mai i nga momo matatini whakatairite ma te whakaaro ki nga tauwhitinga motuhake o te roanga ≥ 10 ns.Ko te tawhitinga tapahi kaihoko-a-hiri i whakaritea ki te 3.5 Å, a, ko te koki tapahi kaikoha-H-kaitono kua whakaritea ki te ≥ 160°-180°.(D) Ko nga toenga kua tapaina e hanga ana i nga tauwhitinga pūmua-pūmua HLA-A me o raatau hoa, ≥ 20 ns, i tangohia mai i nga matatini HLA-A-H2B me HLA-A-HMGA1.Ko nga hanganga pūmua e tohu ana i te hanganga toharite o te 100 ns MDS.(E) Whakawhitiwhitinga i waenga i nga matatini HLA-A-H2B me HLA-A-HMGA1 i whakaritea ki nga taunekeneke i whaihia e te H2B-HLA whaihanga i runga i te 100 ns i runga i te waahi taunekeneke K, S ranei i waenga i nga peptides e rua.Matatini /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Ko te uara paepae mo te aromautanga o nga hononga-whakawhitinga i whakaritea ki te 3.0, me nga taunekeneke motuhake mai i te MDS tango ≥ 10 ns i whakaarohia.I whakaatahia nga hanganga pūmua ma te BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) me te Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).
Ko te pumau o nga ngota ngota HLA-A i roto i te waa (te rerekee paerewa; RMSD, te rereke paerewa ranei; RMSF) i tohu ko te noho o nga pūmua H2B, HMGA1 ranei i roto i nga matatini i whakapumau i te HLA-A (Whakaahua 8B, Whakaahua S5).Ka herea te pūmua HMGA1 ki te pae B2M o HLA-A, ka whakaawe i te pumau o nga waikawa amino HLA-A i roto i te matatini HLA-A-HMGA1 ranei H2B-HLA-A-HMGA1 (Whakaahua 8B, Whakaahua S5).ina koa, ko nga toenga HLA ~ 60-90 me ~ 180-210 i kitea he iti ake te ngawari ki te aroaro o H2B (FIG. 8B).Ko te H2B me te HMGA1 i whakaatu i te pai ake o te here ki te HLA-A i roto i te matatini H2B-HLA-A-HMGA1 i whakaritea ki te HLA-A e herea ana ki te H2B ranei HMGA1 anake (Whakaahua 8C, D; Ripanga S5).Ko nga toenga e uru ana ki te hononga hauwai (kua whakatauirahia e MD te noho teitei ≥ 10 ns) ka rite ki nga waahi taunekeneke CLMS (nga toenga K, S ranei) i roto i te matatini, e kii ana he tino pono nga tauwhitinga kua tohua e CLMS.Te Whakapono (Fig. 8E).I roto i te whakatauira CLMS me MD, ko nga toenga HLA-A i waenga i te 190-210 me te 200-220 nga waikawa amino i kitea hei here i te H2B me te HMGA1 (FIG. 8E).
Ko nga taunekeneke pūmua-pūmua e hanga ana i nga hononga hanganga hihiri e takawaenga ana i te whakawhitiwhiti i roto i nga pūtau hei whakautu ki etahi whakaohooho.Na te mea he maha nga huarahi proteomics ka kitea nga huringa o te taumata tuturu katoa o te pūmua, ka hiahia te hihiri o te taunekeneke pūmua-poromua ki etahi atu taputapu hei hopu i nga hononga hono, a ko te CLMS tetahi o aua taputapu.Ko te punaha tohu tohu interferon he whatunga cytokine e taea ai e nga pūtau te whakautu ki te whānuitanga o nga tohu pathological pathogenic me te intrinsic, ka mutu i roto i te whakauru o nga waahanga o nga pūmua interferon-inducible.I tono matou i te CLMS ki te whakatau mena ka taea te tautuhi i nga taunekeneke pūmua-pūmua hou i roto i te roopu o nga pūmua-a-roto.I whakamahia te tātari hononga-whakawhitinga pūmua o te ao i roto i te tauira pūtau Flo-1 whakautu interferon hei hopu i nga matatini pūmua.Ko te tangohanga o nga peptides tryptic mai i nga pūtau hono-kore me te hono-whakawhiti ka taea te tatau peptide, te whakarangatira ara, me te tohatoha roa peptide me te kaha LFQ kua tautuhia.Ko nga pūmua canonical interferon-inducible i tohuhia he mana pai o roto, i te wa i kitea nga taapiri hou o te intermolecular me te intramolecular o nga pūmua interferon-inducible canonical penei i te MX1, UP18, OAS3 me STAT1.Kua whakatewhatewhahia nga momo hanganga me nga taunekeneke i roto i nga waahanga mahi.
Ko te taunekeneke i waenga i te HLA-A, MDN1 me te H2B i kitea e te immunoblotting i roto i nga ruma Flo-1 me A549 i tukinotia me te kore i tukuna ki te IFNα.Ko o maatau hua e whakaatu ana ko te HLA-A matatini me te H2B i roto i te tikanga whakawhirinaki-IFNα.Ko ta maatau mahi he huarahi whakamere mo te torotoro haere i te waahi-a-rohe o enei whare matatini e rua.He mea rawe hoki ki te whakawhänui i te huarahi CLMS ki te röpü o ngä rärangi pütau ki te tautuhi i ngä pähekoheko pümua-momo-momo-motuhake.Ka mutu, i whakamahia e matou te whakatauira MD hei huarahi rereke kia mohio ai matou ki te whakanekeneke o nga pūmua e uru ana ki roto i te matatini H2BFS-HLA-A-HMGA1, i whai i nga korero whakawhiti i roto i te imolecular me te intermolecular.Ko nga korero mai i nga raraunga CLMS e whakaatu ana te ahua o nga ahuatanga rereke o nga pūmua H2BFS, HLA-A, me HMGA1.Ko nga ahuatanga rereke pea i waenga i enei huinga pūmua tauranga i kitea he maha nga taunekeneke e rite ana ki era i kitea i roto i te huingararaunga CLMS.Ko tetahi o nga tino kaha o to maatau tikanga he ngawari ki te tautuhi i nga ira tino polymorphic penei i te HLA, na reira ka pai ki te ako i nga taunekeneke o nga pūmua HLA haplotype-motuhake he uaua ki te ako.Ka huihuia, ka whakaatuhia e o maatau raraunga ka taea te whakamahi CLMS ki te whakawhānui ake i to maatau mohiotanga ki nga whatunga tohu-a-interferon me te whakarato i te kaupapa mo te ako i nga punaha intercellular uaua ake i roto i te taiao moroiti puku.
I riro mai nga pūtau Flo-1 mai i te ATCC me te pupuri i roto i te DMEM (Gibco) kua taapirihia ki te 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% fetal bovine serum (Gibco) ka rongoa ki te 37°C me te 5% CO2.Whakanuia.I tipuhia nga pūtau ki te 70-80% te whakakotahitanga i mua i te rongoa me te IFNα14 (i hangaia e Edinburgh Protein Production Facility).Ko etahi atu matū me nga reagents katoa i hokona mai i a Sigma Aldrich mena kaore he korero.
I whakatipuhia nga ruma Flo-1 i roto i nga pereti 6-puna me te ra i muri mai ka tukuna nga ruma ki te 10 ng/ml IFNα14 mo te 24 haora ki te 80% te whakakotahitanga.I horoia nga pūtau e toru nga wa ki te PBS me te hono ki te DSS hou (Thermo Fisher Scientific) (kua whakakorehia ki DMSO) i roto i te PBS mo te 5 min i te 37 ° C. ki te kukū whakamutunga o 0.5 mM.I whakakapihia te tauhohenga whakawhiti DSS ki te PBS me te toenga o te DSS i tineia ma te taapiri i te 20 mM Tris (pH 8.0) ki te PBS mo te 15 meneti i te 37°C.I kohia nga pūtau ma te tarai, ka kohia ki roto i nga ngongo here iti (Axygen).
I lysed te pire pūtau ki te 300 µl o te urea lysis buffer (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) mo te 30 min i te pāmahana rūma me te wiri i etahi wa.Ko nga hikoinga centrifugation katoa i mahia i te 14,000 xg i te 8°C.Whakanuia te lysate mo te 10 meneti ka whakawhitia te supernatant ki te ngongo hou.Ko nga matūriki marama e toe ana i rewa i roto i te 150 μl o te rua o te lysis buffer (2 M urea, 2% (w/v) SDS (konutai dodecyl sulfate)) mo te 30 meneti neke atu ranei kia riro mai he wairewa wai rite.Ko te lysate i centrifuged mo te 20 meneti ka konatunatua te supernatant ki te lysate i whiwhi i te taahiraa o mua.I aromatawaihia nga kohinga pūmua ma te whakamahi i te Micro BCA assay (Thermo Fisher Scientific) i runga i nga tohutohu a te kaihanga mo nga tikanga moroiti.I tere whakatotoka nga tauira ki roto i te hauota wai, ka rongoa ki te -80°C.
Tata ki te 100 μg o te pūmua honohono-whakawhiti whakarewa i tukatukahia ma te whakamahi i te kawa whakarite tauira filtration tauira (FASP) kua whakarereketia e Wisniewski et al.69 He poto nei, ka honoa te pūmua ki te 200 µl o te urea buffer (8 M urea i roto i te 0.1 M Tris, pH 8.5), ka vortex ka haurua.Ko nga hikoinga centrifugation katoa i mahia i te 14,000 xg i te 25°C.Ko te haurua tuatahi o te lysate pūmua hono-whakawhitinga i whakawhitia ki te taputapu tātari centrifugal 10 kDa Microcon kua whakauruhia ki te membrane Ultracel-10 (Merck), ka whai i te centrifugation i runga i te tātari mo te 25 meneti.Kātahi ka tāpirihia te haurua tuarua o te pūmua ki te tātari me te whakahoki ano i nga mahi.I mahia te whakaora pūmua mā te tāpiri 100 μl o te 17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) ki roto i te urea buffer.I whakakorikoria te whakaoranga i runga i te thermomixer i te 600 rpm mo te 30 meneti i te 37°C.I tua atu, i centrifuged te tīwae, me te whakaiti i te pūmua ripeka-hono kua alkylated whakamahi 100 μl o 50 mM iodoacetamide i roto i te buffer Urea.I kawea te tauhohenga alkylation i te pāmahana rūma mo te 20 meneti i roto i te pouri.Hurihia te pou, horoia nga pakitara o te pou kia 3 nga wa ki te 100 µl urea buffer, katahi ka centrifuge.Ko te mahi ano i mahia e 3 nga wa ma te whakamahi i te 100 μl o te 100 mM ammonium bicarbonate.I mua i te trypsinization, whakakapihia te ngongo kohinga ki te mea hou.Tāpirihia he pūrei nakunaku kei roto te 50 mM ammonium bicarbonate me te 1 µl trypsin kua waimeha ki te parare trypsin (Promega).Ko te ōwehenga o te trypsin ki te pūmua ka mau tonu ki te 1:33, ka whakakororiahia nga tauhohenga nakunaku i te po i te 37° C. i roto i te ruma makuku.Ko te peptide kua honoa i whakahekehia mai i te tātari ma te centrifugation mo te 25 meneti.I pai ake te whakaora Peptide ma te taapiri i te 50 μl o te 0.5 M NaCl ki te tātari, ka whai i te centrifugation mo te 25 meneti.
I whakamahia nga pou C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) ki te whakakore i nga peptides tryptic honohono-whiti i muri i te kawa i whakaahuatia e Bouchal et al.70 me nga whakarereketanga iti.I te wa poto, i whakahohehia nga pou hurihuri C18 me nga horoinga e toru o te 0.1% waikawa formic (FA) i roto i te acetonitrile (AcN) (Merck) me nga horoinga e rua o te 0.1% FA.I whakamakukuhia te pou ki te 0.1% FA mo te 15 meneti.Utaina nga tauira ki roto i nga pou hurihuri ka horoi kia 3 nga wa ki te 0.1% FA.Ko nga peptide kua whakakorehia i te wa i whakaemihia ki te rourou ma te whakamahi i te 50%, 80% me te 100% AcN i te 0.1% FA.I whakamarokehia nga tauira ki roto i te whakamaroke SpeedVac Plus (Eppendorf) kia ngaro rawa atu te toenga wai.Ko nga peptides kua whakakorehia i whakakorehia i roto i te 100 μl o te 0.08% te waikawa trifluoroacetic i roto i te 2.5% AcN me te ine i runga i te NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Tata ki te 1 μg o te peptide whakawhiti mo ia tauira i werohia ki te punaha LC-MS/MS.
I wehea nga peptide hono-whakawhiti i runga i te punaha UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) e hono ana ki te Orbitrap Exploris 480 papatipu hiko (Thermo Scientific).I kohia nga peptide hono-whakawhiti i runga i te 300 µm ID, 5 mm te roa µ-mua-tīwae C18 tīwae hopu kikī ki te C18 PepMap100 sorbent me te 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Utaina te rere o te papu ki te 5 µl/min 0.08% waikawa trifluoroacetic kua memeha ki te 2.5% AcN.I wehea nga peptide hono-whakawhiti i runga i te tiihi silica kua whakakotahihia me te diameter o roto o te 75 μm me te roa o te 150 mm, ka whakakiia ki te 2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Ko nga waahanga pūkoro A me B ko te 0.1% FA i roto i te wai me te 0.1% FA i roto i te acetonitrile.Ka timata te rōnaki i te 2.5% B ka piki ki te 40% B i roto i te 90 meneti, ka ki te 90% B i roto i nga meneti 2 e whai ake nei.I mau tonu te hanganga o te wahanga pūkoro ki te 90% B mo te 10 meneti ka heke ki te 2.5% B mo te 2 meneti.I whakaōritehia te tīwae ki te 2.5% B mō te 8 meneti i mua i te huringa o muri.Ko nga peptide hono-whakawhiti i mawehea mai i te pou wetewete i katote i roto i te puna katote nanoelectrospray (NSI) ka werohia ki roto i te Exploris 480 papatipu spectrometer (Thermo Scientific).
Ko te Orbitrap Exploris 480 papatipu hiroki i whakahaeretia i roto i te aratau honohono raraunga pai.I mahia he karapa katoa i te aratau waahanga i te taumira 120,000 me nga tautuhinga awhe mai i te m/z 350 Th ki te m/z 2000 Th.Ko te whaainga AGC kua whakaritea ki te 300% me te wa whakauru morahi o te 50ms.Kua whakatauhia te kitenga tihi monoisotopic mo nga peptides.Ka tautuhia te tawhā whakangawari here ki te pono mena he iti rawa nga tohu ka kitea.Ko te iti rawa o te kaha o te katote o te katote i whakaritea ki te 5.0e3 me te kii i te utu o mua ki te +8 i whakauruhia ki roto i nga whakamatautau.
Ko te wa huringa i waenga i nga karapa nui i roto i te aratau whakamaarama raraunga i whakaritea ki te 2.5 hēkona.I whakaritea te whakakorenga papatipu hihiko ki te 20 s i muri i te wehenga tuatahi o te katote katote.I tautuhia te matapihi wehe i mua ki te 2 Th.Ko te momo o te pūngao tukinga pūnoa me te aratau pūngao tukinga i tohua i roto i te karapa MS/MS e whakawhirinaki ana ki nga raraunga.Te pūngao tukinga kua whakaritea ki te 30%.Ko te whakataunga Orbitrap i whakaritea ki te 15,000 me te whaainga AGC ki te 100%.Kua whakaritea te wa weronga morahi ki te 60 manomano.
I mua i te aroturuki i te whatunga pūmua-pūmua i roto i nga tauira hono-whakawhitinga, i tukatukahia e matou nga konae mata ma te whakamahi i te kete MaxQuant (putanga 1.6.12.0)26,27 ki te tautuhi i nga peptides / pūmua kei roto i nga tauira.I tua atu, he rite nga tātaritanga proteomic i mahia i runga i nga tauira Flo-1 kaore i whakawhitia i tukinotia me te kore i tukuna ki te IFNα.I rapuhia nga raraunga MS/MS i te papaaarangi tangata UniProt (www.uniprot.org) (i tukuna mai i te 12 o Akuhata 2020, e 75,093 nga whakaurunga) ma te whakamahi i te miihini rapu Andromeda27.I whakahaeretia te rapunga me te kore e tohu i te motuhake o te enzyme me nga momo whakarereketanga o te deamidation (N, Q) me te oxidation (M).I whakaritea nga katote papatipu o mua ki te 20 ppm me nga katote hua ki te 0.02 Da.I whakaritea te inenga papatipu tuatahi me te morahi ki te 10 ppm.Ko te papatipu teitei o te peptide i whakaritea ki te 4600 Da me te raupapa orite i whakaritea i waenga i te 7 me te 25 waikawa amino (aa).I mahia ano he tātaritanga tauanga ma te whakamahi i te kaupapa Perseus (putanga 1.6.10.45).Ko te ihirangi pūmua i tātaihia ma te whakarite i te kaha hihiko o te pūmua (te kaha LFQ; te inenga kore tapanga)27 ka huri nga uara kaha ki te Log2.I hangaia he kohinga arowhai o nga pūmua i tautuhia e to ratou kaha peptide ma te whakamahi i te mapi pheatmap (v1.0.12) i roto i te R (v 4.1.2).I mahia te tātaritanga whakarangatira i te ara ma te whakamahi i te paataka ara Reactome mo nga pūmua i tukinotia e IFNα kua neke ake i te wha nga wa i whakahohehia ai ki nga tauira kaore i mahia.
Ko te tautuhi i te lysine (K) me te serine (S) nga hononga matū motuhake o nga matatini pūmua i aroturukihia e te LC-MS / MS i mahia ma te whakamahi i te miihini tautuhi spectroscopic (SIM-XL) mo nga peptides hono-whiti (SIM-XL)29.Tuatahi, i tirotirohia nga taunekeneke i waenga i te interferon-associated (IFN) DNA damage resistance signature (IRDS) ira ira ma te whakamahi i te huinga raraunga pūmua IRDS i whakaahuahia i Padariya et al.28.Ko te tirotiro i nga tikanga katoa me te tukuruatanga o te UniProt tangata katoa he tino kaha ki te tatau, no reira ko te katoa o te patengi raraunga UniProt tangata (www.uniprot.org) (i tikina i te 12 Akuhata 2020, kei roto 75,093 whakaurunga) ki nga tukurua kua tukinotia e IFNα.Ko tetahi o nga whiriwhiringa mo nga taunekeneke whakawhirinaki nui.I whakawhänuihia, i whakamatauria enei tauwhitinga hiranga nui i roto i nga tukurua me nga tikanga katoa.
I roto i te SIM-XL, i whakamahia te DSS mo te whakawhiti (XL) me te whakarereketanga o te taimaha XL me te whakarereketanga o te taumaha i whakaritea ki te 138.06 me te 156.07.Ko nga waahi tauhohenga whakawhiti e whai ake nei ka whakaarohia: KK, KS me KN-TERM, kaore he katote kairīpoata.I whakaritea nga ppm o mua me te kongakonga ki te 20 me te paepae Xrea ki te 0.15.I whakaarohia he tino motuhake a Trypsin, a, i whakatinanahia he tikanga wehewehenga C-trap (HCD).Ko te XCorr dynamic DB reduction paepae me te iti rawa o nga peptides mo te whakahekenga DB hihiri i whakaritea ki te 2.5 me te 2, ia.Ko etahi atu tawhā ko: te tūponotanga monoisotope me te peak coincidence cutoff, iti rawa 4 toenga AA mo ia whenu me te utu morahi mo te whenu, me te 3 te teitei o nga wehenga kua ngaro.I tātarihia nga mapi 2D i tuituia i roto i te (SIM-XL) ka whakamahia te whakaaturanga kauwhata xQuest28 hei hanga mapi 2D.Ko nga hononga whakawhiti pūmua i runga i nga hanganga pūmua kei te PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, putanga 2.0 Schrödinger, LLC).
I hangaia nga hanganga tauira pūmua ma te whakamahi i te tūmau Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 mā te whakamahi i ngā mātāpono o te whakatauira homology me te whakatinanatanga o te “Hidden Markov Method”.Ka hangaia e Phyre2 nga hanganga tauira i runga i te raupapa raupapa me nga hanganga pūmua e mohiotia ana.Mo nga pūmua H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, me MDN1, i whakamahia nga hanganga tauira 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, me 6i2665.I tua atu, i whakaarohia ano te hanganga o AlphaFold71 MX1, UBP18 me ROBO1.I whakaatahia te hanganga pūmua ma te whakamahi i te kete BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) me te kohinga Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).