ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Mo te Ahumahi matū Ahumahi matū, Ko te ngoikore o te SPECC1L ka piki ake te pumau o nga hononga hono me te whakaheke i te whakahekenga o nga pūtau neural crest cranial.

Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Kei te whakamahi koe i tetahi putanga tirotiro me te tautoko CSS iti.Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tua atu, hei whakarite i te tautoko tonu, ka whakaatuhia e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Mo te Ahumahi Matū

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.Ko te kaihanga matua e tohunga ana ki nga putorino kowiri tira, ngongo ngongo kanapa, ngongo kowiri tira, aha atu.Hei whakangawari i nga kaihoko, he paipa paipa me nga ngongo hoki taatau.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.kei a ia nga taputapu whakaputa me nga taputapu whakamatautau.Ka taea e matou te tino makona i to hiahia.E ai ki nga paerewa tino kaha, ko nga ngongo i mahia e matou he tika tonu te OD me te WT.Ko te mana o te manawanui he tino rite ki nga paerewa whakaputa.Ka makona tonu a maatau hua ki nga kaihoko.I hokona e nga kaihoko a maatau hua ka nui ake nga hua.
a) OD ( Outer Diameter ) : 3.18mm ki te 101.6mm
b) WT ( Matotoru Taiepa ) : 0.5mm ki te 20mm
c) Te roa : E ai ki te hiahia a te kaihoko
d) Paerewa : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 etc
e) Tikanga Tukatuka : ERW, EFW etc

Rēreti e whakaatu ana i nga tuhinga e toru mo ia kiriata.Whakamahia te patene o muri me te taha o muri hei nuku i roto i nga kiriata, ko nga paatene mana kiriata kei te pito ki te neke ma ia kiriata.
Ko nga pūtau neural crest cranial (CNCC) ka whakaheke i nga kopa neural embryonic ka heke ki nga kikorangi pharyngeal, e hanga ana i te nuinga o nga hanganga o waenganui.He mahi nui a CNCC i roto i te etiology o te kowhatu orofacial, he mate whanoke noa.Kua kitea nga rerekee SPECC1L Heterozygous i roto i nga turoro me nga kapiti atypical me te syndromic.I konei, ka ripoatahia e matou te whakapai ake i te whakakikoruatanga o nga waahanga whakapiri kanonika (AJ), te β-catenin me te E-cadherin i roto i nga pūtau patupatu SPECC1L, me nga miihini hiko e whakaatu ana i te horahanga apical-basal o AJ.Kia mohio ai matou ki te mahi a SPECC1L i roto i te morphogenesis craniofacial, i hangaia e matou he tauira kiore ngoikore Specc1l.Ko nga mutants Homozygous he mate embryonic me te whakaatu i te katinga ngongo neural ngoikore me te raima CNCC.Ka piki ake te poke pūmua AJ i roto i nga kopa neural mutant.Ko tenei koha AJ he rite ki te hapa i roto i te delamination CNCC, e hiahia ana kia whakakorehia te AJ.I tua atu, kua whakahekehia e nga mutants Specc11 te tohu PI3K-AKT me te whakanui ake i te apoptosis.I roto i te vitro, ko te aukati ngawari o te tohu PI3K-AKT i roto i nga momo momo mohoao i ranea hei akiaki i nga huringa AJ.Ko te mea nui, ko nga huringa AJ na te SPECC1L knockdown ka taea te huri ma te whakahohe i te ara PI3K-AKT.Ko enei raraunga e kii ana ko SPECC1L, hei kaiwhakahaere pukapuka mo te tohu tohu PI3K-AKT me te koiora AJ, e hiahiatia ana mo te katinga ngongo neural me te stratification CNCC.
Ko nga pūtau neural crest cranial (CNCCs) te waahi ki te neuroectoderm dorsal me te wehe mai i te neuroepithelium o te whakawhanaketanga o nga kopa neural na roto i te tukanga e pa ana ki te whakawhitinga epithelial-mesenchymal (EMT)1,2,3.Ko nga CNCC epithelial o mua ka whakararu i nga hononga o waenga pūtau, ka huri hei CNCC mesenchymal e whakaki ana i nga kikorangi pharyngeal tuatahi me te tuarua, ka hanga i te nuinga o te cartilage craniofacial.No reira, ko nga ira e whakahaere ana i te mahi CNCC he maha nga wa ka pakaruhia i roto i te etiology o te craniofacial congenital anomalies penei i te kowhatu orofacial, te nuinga o te nuinga o te wa e pa ana ki te 1/800 whanau i te US anake.Ko tetahi o nga mate whanautanga8.
Ko te whakakore i te CNCC ka rite ki te katinga o te ngongo neural o mua i waenga i te 8.5 me te 9.5 ra o te whanaketanga embryonic i roto i nga kiore.Ko nga mutants o te maha o nga ira kiore orofacial cleft-related ira e whakaatu ana i etahi ahua o te koha ngongo neural, tae atu ki a Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, me Pdgfrα12.Engari, ko nga tukanga o te katinga ngongo neural me te CNCC stratification ka taea te whakaaro motuhake, i te mea ko te Splotch mutant kiore (Pax3) e whakaatu ana i nga hapa i roto i te katinga ngongo neural me te kore he painga ki te CNCC stratification, te heke 13,14.Ko etahi atu tauira kiore he koha i roto i te wehenga CNCC me te katinga ngongo neural ka awhina i te whakatau i te turanga ngota ngota o enei tukanga e rua.
Ko te wehenga o te CNCC mai i nga pūtau neuroepithelial e hiahia ana ki te whakakore i nga hononga piri (AJs), he mea hanga i nga huinga pūmua kei roto, me etahi atu, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, me te α-actinin e hono ana ki nga filaments actin 2 Ko nga rangahau overexpression E-cadherin i roto i nga kopa neural i whakaatu i te whakahekenga, i te whakaroa ranei i te delamination CNCC.I tua atu, ko te whakakore i te E-cadherin ka puta he stratification wawe15,16.Ko te nuinga o nga mea hei takawaenga i te EMT i te wa o te whakawhanaunga CNCC ko nga take tuhi (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) me te matrix extracellular (ECM) remodeling proteins pera i te matrix metalloproteinases (MMPs), engari he tika nga CNCCs cytoskeletal AJ regulators. kaore ano kia mohiotia.Ko te ara PI3K-AKT e mohiotia ana hei whakahē i nga taumata E-cadherin, ko te nuinga mai i te rangahau mate pukupuku17.Kua whakaatuhia e nga rangahau o tata nei ko te ngaro o te tohu PI3K-AKT e pa ana ki te PDGFα i roto i nga kiore ka arai ki nga kino o te craniofacial, tae atu ki te kowhatu ngutu me nga ngoikoretanga ngongo neural12.Engari, ko te hononga i waenga i te huarahi PI3K-AKT me te AJ pumau i runga i te paparanga CNCC kaore i te maarama.
I tautuhia e matou i mua ko SPECC1L te ira mutant tuatahi i roto i nga tangata e rua he ngau kino ka toro atu i te waha ki te kanohi, e mohiotia ana ko te kowhatu oblique (ObFC) ko Tessier IV18 cleft ranei.Kua kitea nga rerekeetanga SPECC1L i roto i nga whanau maha e rua me te mate autosomal dominant Opitz G/BBB syndrome (OMIM #145410), i whakaatuhia ai e nga tangata i pa te tawhitinga me te ngutu ngutu/parate19, me te whanau kotahi kua mate Tibi overdistance syndrome (OMIM #145420)20 .neke atu i te haurua o nga keehi o Opitz G/BBB syndrome he hononga-X (OMIM #300000) ka puta mai i nga huringa i roto i te ira MID1, e whakawaehere ana i te pūmua 22 o te anga anga o te microtubule-associated cell skeleton.E whakapae ana matou ko te SPECC1L, he pūmua ano hoki e hono ana ki te microtubules me te cytoskeleton actin, ka taea te takawaenga i nga tohu e hiahiatia ana mo te whakarereketanga o te cytoskeleton actin i te wa e piri ana me te heke 18.Na roto i nga rangahau in vitro me in vivo, ka whakaahuahia e matou a SPECC1L hei kaiwhakahaere pukapuka mo te pumau AJ ma te tohu tohu PI3K-AKT.I te taumata pūtau, ko te ngoikoretanga o te SPECC1L i heke iho te taumata o te pūmua pan-AKT me te piki ake o te marara apical-basal o AJ, i whakakorehia e te mahi matū o te ara AKT.I roto i te vivo, ka kitea e nga embryos Specc11-kore te katinga ngongo neural me te whakaheke i te wehenga CNCC.No reira, ka mahi a SPECC1L i roto i nga tohu tohu-a-ringa-a-ringa kua whakaritea mo te mahi CNCC noa i te wa o te morphogenesis kanohi.
Hei tohu i te mahi a SPECC1L i te taumata pukoro, i whakamahia e matou te raina pūtau osteosarcoma pumau U2OS i te SPECC1L18.Ko enei pūtau U2OS pumau me te SPECC1L (kd) te paheketanga he iti (60-70%) te heke o nga taumata o nga tuhinga SPECC1L me nga pūmua, me nga hapa o te heke me te whakatikatika i te cytoskeleton 18. Ko te SPECC1L kua whakaatuhia ki te arahi ki nga koha mitotic 23 .I runga ano i nga ahuatanga, i kite matou i whakarereke a maatau pūtau SPECC1L-kd i te ahua o te ahua i te tino teitei o te hononga (Whakaahua 1).He rite te ahua o nga pūtau mana takitahi me nga pūtau kd i te hononga iti (Whakaahua 1A,D).24 haora i muri i te whakakotahitanga, ka mau tonu te ahua o nga pūtau whakahaere (Fig. 1B, E), i te wa e roa ana nga pūtau SPECC1L-kd (Fig. 1C, F).Ko te whanuitanga o tenei huringa o te ahua o nga pūtau i hopukina e te whakaahua ora i roto i te vivo o nga pūtau whakahaere me nga pūtau kd (kiriata 1).Hei whakatau i te mahi a SPECC1L i roto i nga pūtau whakakotahi, i tirohia tuatahitia e matou tona whakaaturanga.I kitea e matou i piki ake nga taumata pūmua SPECC1L i runga i te whakakotahitanga (Whakaahua 1G), engari kaore i piki nga taumata tuhinga SPECC1L (Whakaahua 1H).I tua atu, i te piki ake o te kiato o te pūtau, ka whakaemihia te pūmua SPECC1L ki nga rohe o waenga pūtau (Fig. 2A-E), me te tauira e inaki ana ki te β-catenin-a-membrane (Fig. 2A'-E').I runga i te hononga o SPECC1L me te actin cytoskeleton 18,23 i whakapaehia e matou ko te SPECC1L te taunekeneke me nga hononga taapiri-a-actin (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) pūtau e roa ana i te hononga teitei (F) whakaritea ki te whakahaere pūtau U2OS (AC).E whakaatuhia ana i konei e toru o nga wa e ono (T1, T3, T6) i tohua e matou mo nga kiatotanga o nga pūtau rereke.(G) Te wetewete o te hauauru e whakaatu ana kei te whakapumau te pūmua SPECC1L i te taumata teitei o te whakakotahitanga ki te iti o te hononga i roto i nga pūtau whakahaere.Ko te paraka o te hauauru o SPECC1L e whakaatu ana i te roopu 120 kDa e tumanakohia ana me te roopu taumahatanga rapoi teitei ake, tera pea i whakarereke i muri i te whakamaoritanga (*).I mahia te wetewete o te uru ki raro i nga tikanga ano mo te whakakotahitanga iti me te teitei.Ko nga whakaahua e whakaatu ana i te SPECC1L i te hononga iti me te teitei i tangohia mai i te waahi kotahi.Ko taua parapara ano i tangohia, ka tirotirohia ano me te antibody β-actin.(H) Ko te tātaritanga RT-PCR ine karekau he huringa nui i roto i nga taumata tuhinga SPECC1L.Ko nga pae hapa e tohu ana i nga SEM mai i nga whakamatautau motuhake e wha.
(AE) I whiriwhiria e matou nga tohu wa e ono (T1-T6) e tohu ana i te awhe o te kiato pūtau hei whakarite i te tātaritanga ahua pūtau me nga huringa AJ i roto i nga pūtau U2OS me te SPECC1L knockdown (kd).Ko nga waahi tuatahi e rima o enei waahi ka uru ki roto i nga pūtau kotahi (T1), 50-70% te whakakotahitanga o nga kahui pūtau iti (T2), te whakakotahi me te kore e hanga ano i nga pūtau kd (T3), te whakahou i nga pūtau kd (T4), me nga huringa 24 haora.i te ahua o muri o nga pūtau kd (T5).Ko te pūmua SPECC1L te nuinga i marara i roto i te cytoplasm i T1 (A), engari i kitea tona whakaemi i nga rohe intercellular i nga waahi o muri mai (B–E, pere).(FJ) β-catenin e whakaatu ana i te kohikohinga rite ki nga rohe o waenga pūtau e hono ana ki te matatini AJ.(A'-E') Ko te SPECC1L me te β-catenin e whakaatu ana i te tae inaki ki nga taitapa pūtau i te kiato pūtau teitei (pere).(F'-J') I roto i nga pūtau SPECC1L-kd, he ahua noa te whakakikorua o te β-catenin ki te iti o te kiato pūtau (F'-H'), engari ka whakawhānui ake i te huringa o te hanga pūtau (I', J'; pere), e tohu ana ko AJ kua huri.Pae = 10 µm.
Na ka ngana matou ki te whakatau i te paanga o te ngoikoretanga o te SPECC1L ki te AJ.I whakamahia e matou etahi tohu tohu-a-AJ, tae atu ki nga waahanga canonical F-actin, myosin IIb, β-catenin, me E-cadherin24,25,26,27.I piki ake nga muka ahotea Actin i roto i nga pūtau SPECC1L-kd i whakaahuatia i mua (Fig. 3A,B) 18 .Ko te Myosin IIb e hono ana ki nga kakawaea actin i whakaatu i te pikinga rite ki nga pūtau SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C,D).Ko te β-catenin e hono ana ki te AJ e hono ana ki te cadherin i te membrane pūtau, e whakaatu ana i te tauira whakahuatanga "honeycomb" i roto i nga cubocytes whakahaere (Fig. 3E, G).He mea whakamiharo, i roto i nga whakaahua papatahi e whakamahi ana i te microscopy confocal, β-catenin (Fig. 3E,F) me te E-cadherin (Fig. 3G,H) te whakapouri i runga i te membrane pūtau o nga pūtau ngoikore SPECC1L-whakauru i whakaatu i nga tauira rongonui o te tae roa.Ko tenei roha o te whakakikoruatanga β-catenin e hono ana ki te AJ i roto i nga pūtau kd i tino whakahuahia i te huihuinga, engari i puta i mua i nga huringa o te ahua o te pūtau (Fig. 2F-J, F'-J').Hei whakatau i te ahua-a-tinana o tenei whakamaarama AJ roa, i tirotirohia e matou nga taitapa pūtau i runga i te mata apical-basal o nga pūtau SPECC1L-kd U2OS ma te tuku irahiko miihini (TEM) (Whakaahua 3I,J).He rereke ki nga pūtau whakahaere (Fig. 3I), he motuhake nga rohe hiko irahiko e tohu ana i te AJ (pere), ko nga pūtau kd (Fig. 3J) i whakaatu i nga rohe nui, pirihono o te kiato irahiko teitei e tohu ana i te AJ i te taha o te rererangi apicobasal..I tua atu, i runga i nga waahanga whakawhiti, i kitea e matou he nui nga piupiu membrane pūtau i roto i nga pūtau kd (Fig. S1A,B), e whakamarama ana i te tauira roa o te β-catenin me te E-cadherin staining bands (Fig. 3F,H).Hei tautoko i te mahi a SPECC1L i roto i nga AJs, ko te β-catenin i whakauruhia ki te SPECC1L i roto i nga lysates o nga pūtau U2OS honohono (Fig. 3K).I te taha o te whakamaaramatanga whakaahuru mo nga tohu AJ, i rite te tātari TEM ki ta matou whakapae ko te ngoikoretanga o te SPECC1L ka piki ake te AJ apical-basal kiato me te rereketanga.
(AH) Kua piki ake te whakapouri F-actin i roto i nga ruma kd i nga haora 48 i muri i te whakakotahitanga (T6; A, B).Ko te whakakikoruatanga o te myosin IIb e hono ana ki te F-actin (C, D).Ko te tauira maeneene o te β-catenin me te E-cadherin membrane staining i roto i nga ruma whakahaere (E, G) i whakareihia i roto i nga kamera SPECC1L-kd (F, H).Pae = 10 µm.(I–J) Nga moroiti irahiko e mataki ana i te hononga o te apical-basal intercellular junction.Ko nga pūtau mana e whakaatu ana i nga rohe hiko-a-ira motuhake e tohu ana i nga hononga piri (I, pere).I te rereke, ko te katoa o te hononga apical-basal i roto i nga kamera SPECC1L-kd i puta he irahiko kiato (J, pere), e tohu ana i te piki haere o te kiato me te marara o nga hononga piri.(K) β-catenin i whakahuihuitia ki te SPECC1L i roto i nga lysates pūtau U2OS.He whakaahua i tangohia mai i tetahi waahi e tohu ana i tetahi o nga whakamatautau motuhake e wha.
Kia mohio ai matou ki te mahi a SPECC1L i roto i te morphogenesis craniofacial, i hangaia e matou he tauira kiore ngoikore o Specc1l ma te whakamahi i nga raina pūtau mahanga ES e rua, DTM096 me RRH048 (BayGenomics, CA), e tohu ana i nga tuhinga intron 1 me Specc1l i hopukina i te 15 (Fig. 1) .4A, ahua S2).Ko te waahi ira tangata o te whakaurunga vector decoy i whakatauhia e te raupapa ira tangata katoa me te whakapumau e te PCR (Fig. S2).Ko nga hoahoa mahanga ira e rua i taea te whakakotahi i roto-anga o nga kairipoata Specc11-lacZ i te hopukina.Na reira, ko te whakaaturanga lacZ i whakatauhia e te tae X-gal i whakamahia hei tohu mo te whakaaturanga Specc11.He rite nga tauira korero lacZ e rua, me te mahanga ira DTM096 i roto i te intron 1 e whakaatu ana i te kaha ake o te korero i te RRH048 i te intron 15 (kaore i whakaatuhia).Heoi ano, ko te Specc1l te whakapuaki whanui, me te tino kaha o te whakapuaki i roto i nga kopa neural i E8.5 (Whakaahua 4B), i roto i te ngongo neural me nga tukanga kanohi i E9.5 me E10.5 (Whakaahua 4C,D), me te whakawhanake i nga peka. i E10.5 me nga kanohi (Whakaahua 4D).I korerohia e matou i mua ko te korero SPECC1L i roto i te kohanga pharyngeal tuatahi i E10.5 kei roto i te epithelium me te mesenchyme18 raro, e rite ana ki te whakapapa CNCC.Hei whakamatautau i te whakaaturanga SPECC1L i roto i te CNCC, i mahia e matou nga waahanga neural E8.5 (Whakaahua 4E-J) me nga wahanga angaanga E9.5 (Whakaahua 4K-).I E8.5, SPECC1L stained neural folded intensely (Fig. 4E, H), tae atu ki nga pūtau kua pokea ki nga tohu NCC (Fig. 4G, J).I E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) i kaha whakapouri i te heke CNCC i whakakikoruatia ki te AP2A (Fig. 4L, M) ranei SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Whakaaturanga hoahoanga o te ira Specc11 kiore e whakaatu ana i te whakaurunga vector whakangao i roto i te ES DTM096 (intron 1) me te RRH048 (intron 15) kiore i te pūtau.(BD) lacZ whakapouri o nga kukuna Specc1lDTM096 heterozygous e tohu ana i te whakaaturanga Specc1l mai i E8.5 ki E10.5.NE = neuroectoderm, NF = neural fold, PA1 = pharyngeal arch tuatahi.(EP) SPECC1L immunostaining ki NCC tohu AP2A me SOX10 i roto i E8.5 (NF; EJ) pōkai neural me E9.5 (KP) wāhanga angaanga.I kitea nuitia te tae o SPECC1L i roto i nga kopa neural E8.5 (E, H; pere), tae atu ki nga pūtau kua tapaina ki te AP2A (F, G; pere) me te SOX10 (I, J; pere).I E9.5, SPECC1L kaha whakapouri i nga CNCC heke (K, N; pere) kua tapaina he AP2A (L, M; pere) me SOX10 (O, P; pere).
Ko te whakawhiti i waenga i nga kiore heterozygous Specc1lDTM096/+ me Specc1lRRH048/+ kiore e whakaatu ana ko nga mahanga ira e rua kaore i te whakakotahi, a ko nga heterozygotes pūhui me nga homozygotes embryonic mo nga mahanga ira e rua he mea whakamate (Ripanga S1).Ko nga tohu Mendelian i tohu i te heke o te oranga o te heterozygotes i te whanautanga (e tumanakohia ana ko 1.34 me te 2.0).I kite matou i te iti o te mate o te whanau i waenga i nga heterozygotes, ko etahi he kino o te craniofacial (Fig. S3).Heoi ano, na te iti o te kuhu o enei tohu tohu craniofacial perinatal he uaua ki te ako i o raatau tikanga pathophysiological.Na reira, i aro atu matou ki te ahua whakamate o te ahua o nga momo rerekee o Specc11 homozygous.
Ko te nuinga o nga kukune heterozygous or homozygous Specc1lDTM096/RRH048 mutant kare i whanake i muri i te E9.5-10.5 (Figs. 5A–D), kaore hoki te ngongo neural i kati ki mua (Fig. 5B, D) i etahi wa ka kati ki muri (kaore i whakaatuhia) ..Ko tenei hapa o te katinga ngongo neural cranial i hono ki te nuinga o te CNCC tohu DLX2 e toe ana i roto i nga kopa neural i E10.5, e tohu ana kaore he wehenga (Whakaahua 5A'-D').Hei whakatau mehemea i whakaitihia ano te rahi o te CNCC, i tohuhia e matou nga raina CNCC me te GFP i roto i o maatau raina mahanga ira me Wnt1-Cre me ROSAmTmG.Ka tohatohahia e matou te GFP+ NCC me te GFP- (RFP+) kore-NCC mai i nga kukune katoa.I te E9.5, karekau i tino rerekee te wahanga o nga CNCC kua tohua ki te rere-whakapapa-GFP i waenga i te WT me nga embryos mutant (kaore i whakaatuhia), e tohu ana i te whakatakotoranga CNCC noa.Na reira, i whakapae matou ko te toenga o te Wnt1-Cre me te DLX2 te whakapouri i roto i nga kopa neural e kitea ana (Whakaahua 5B') na te hapa o te paparanga CNCC, na te nui ake o te kiato, te marara ranei o nga pūtau AJ, penei i kitea i roto i nga pūtau SPECC1L-kd.I whakamahia e matou nga tohu NCC SOX10, AP2A, me DLX2 ki te whakapumau i te noho o CNCC i roto i te kohanga neural (Whakaahua 5E-R).I te E8.5, i kitea te kopa neural mo nga tohu NCC e toru i nga waahanga o WT (Fig. 5E, G, I) me Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).I te E9.5, i te wa i whakapokea e nga tohu NCC te heke o te NCC i roto i nga waahanga WT (Fig. 5M, O, Q), i kitea te toenga o te NCC i roto i nga waahanga neural o Specc1l mutant embryos (Fig. 5N, P, R).Na te SOX10 me te DLX2 e tohu ana i te hekenga o nga CNCC, ko tenei hua e tohu ana ka tutuki nga CNCC-kore-SPECC1L ki te tohu i muri i te hekenga engari karekau e heke mai i nga kopa neural.
Ko te ngoikoretanga o te Specc11 e arai ana ki te katinga ngongo neural kohakore, te whakakorenga o nga pūtau neural neural cranial me nga AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo e kawe ana i te hekenga o nga ruma neural neural crest (CNCC) kua tapaina ki te Wnt1-Cre (A').He rereke, ka whakaatu nga kukune mutant Specc11 i nga kopa neural tuwhera (B), nga upoko pere) me nga CNCC kaore ano kia heke (B', nga upoko pere).(C, D') Nga whakaahua mara kanapa (C, D') me te immunostaining (C', D') o te tohu CNCC DLX2 o E10.5 WT embryos (C, C') me Specc1l (D, D').I roto i te WT E10.5 embryos, DLX2-positive CNCC colonize the gill arches (C', pere), while in mutants, conspicuous staining continues in the open neural folds (D', pere) and in the first pharyngeal arches (D', pere).) me etahi whakapouri (pere) e tohu ana i te delamination kino me te heke o CNCC.ER) Ko nga waahanga o te WT me te Specc1l mutant embryos i nga wahanga E8.5 (E–L) me E9.5 (M–R) i tapaina ki nga tohu NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) me DLX2 (I, J, Q, R).I te E8.5, i kitea te taatai ​​NCC i roto i te momo mohoao neural fold (NF) me nga waahanga mutant.Ko te whakakotahitanga o te SOX10 me te β-catenin i roto i te E8.5 WT (K) me te mutant (L) i whakaatu i te piki haere o te β-catenin ki nga rohe o te pūtau i roto i nga kopa neural.I te E9.5, i kitea te whakapouri mohoao o nga CNCC heke (M, O, Q), i roto i nga mutants, ko nga CNCC kaore i whakakikoruatia i poke i nga kopa neural tuwhera (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ tātaritanga tapanga i roto i nga waahanga korou o WT me Specc11DTM096/RRH048 me te rerekee E9.5.Kei te kokonga matau o runga ka whakaatuhia he rererangi waahanga tata.I roto i nga waahanga o nga kopa mutant, kua kitea te piki ake o te tae o F-actin (S, T) me te myosin IIb (U, V).He rite ki nga hua in vitro i te Fig. 3, i roto i nga embryos mutant, i kitea te whakakikorua o te membrane mo te β-catenin (W, X) me te E-cadherin (Y, Z).(AA-BB) He moroiti irahiko o te waahanga o te momo momo mohoao e titiro atu ana ki tua o te taitapa o te pūtau apical-basal e whakaatu ana i tetahi rohe mato irahiko e tohu ana mo nga hononga piri (AA, pere).He rereke, i nga waahanga o te Specc11 mutant embryos (BB, pere), ko te katoa o te apicobasal junction he irahiko kiato, e tohu ana i te piki haere o te kiato me te marara o nga hononga piri.
Hei whakamatautau i to maatau whakapae na te AJ kua whakarereketia, i tirohia e matou te tapanga AJ i roto i nga kopa neural o Specc1l mutant embryos (Fig. 5S-Z).I kite matou i te pikinga ake o nga muka ahotea actin (Fig. 5S, T) me te piki haere o te waahi o te myosin IIB i whakapouri i runga i nga muka actin (Fig. 5U, V).Ko te mea nui, i kite matou i te piki haere o te tae o te β-catenin (Fig. 5W, X) me te E-cadherin (Fig. 5Y,Z) i nga rohe intercellular.I tirotirohia ano e matou te β-catenin staining o te NCC i roto i nga kopa neural o E8.5 embryos (Fig. 5K, L).Ko te whakakikorua o te β-catenin he kaha ake i roto i te Specc1l mutant neural folds (Fig. 5L and K), e tohu ana kua timata nga huringa AJ.I roto i nga moroiti irahiko o nga wahanga angaanga o te E9.5 embryos, i kite ano matou i te piki haere o te pokenga irahiko-kiato i roto i te Specc1l mutant embryos whakaritea ki te WT (Fig. 5AA, BB me S1E-H).Ka huihuia, ko enei hua ka tautoko i a maatau hua in vitro i roto i nga pūtau SPECC1L-kd U2OS me te kii ko te whakakorikori AJ i mua i te whakawhanaunga o CNCC i roto i o tatou kukune mutant.
I runga i te hononga antagonistic e mohiotia ana i waenga i te mahi AKT me te pumau o te E-cadherin, 17,28 i whakaarohia e matou te whakauru o te tohu tohu PI3K-AKT.I tua atu, i kite matou i te pupuhi i roto i etahi o o matou embryos mutant i mawhiti i te mate (<5%) i te E9.5-10.5, ka noho ki te takiwa o E13.5 (Fig. S3).Ko nga vesicles subepidermal he tohu tohu mo te whakaheke i te tohu PI3K-AKT i runga i te PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) i kii mai ko te whakararu o te whakahohenga PI3K e ahu mai ana i te PDGFRα i roto i te PdgfraPI3K/PI3K mutant embryos ka puta mai nga vesicles subepidermal, ngongo ngongo neural, me nga tohu o te ngutu ngarara.Ae, ko nga taumata o te pan-AKT me te Ser473-AKT phosphorylated kaha i whakahekehia i roto i te vivo i roto i nga kiko mutant Specc1l ki te hopu E9.5 embryonic (Fig. 6A-D).Ko te heke o nga taumata o te phosphorylated Ser473-AKT pea na te hekenga o nga taumata o te pan-AKT i roto i te vivo (FIG. 6E) me te in vitro (FIG. 6F).I kitea te hekenga in vitro anake i te wa e tino hono ana nga pūtau U2OS ki nga huringa o te hanga pūtau me te kiato AJ (Whakaahua 6D).Na, ko o maatau korero e kii ana ko te SPECC1L he kaiwhakahaere pai mo te tohu PI3K-AKT i roto i te morphogenesis craniofacial.
(A–E) E8.5 (A,B) me te E9.5 (C,D) nga wahanga angaanga, E9.5 lysates ranei mai i Specc1l mutant embryos (E) e whakaatu ana i nga taumata o te S473-AKT phosphorylated kaha me te Pan-AKT Whakahekenga Pūmua. , whakaritea ki te whakahaere WT.I mahia te muru ki te Hauauru i runga i nga momo momo mohoao me nga lysates mutant i raro i nga tikanga ano.Ko nga whakaahua e whakaatuhia ana mo SPECC1L i tangohia mai i te waahi kotahi.I tangohia ano taua parapara me te tirotiro ano me nga anti-pan-ACT me te β-actin antibodies.Ko nga taumata Pan-AKT i roto i te E8.5 neural folds (A, B) me nga taumata o te phosphorylated S473-AKT i roto i nga wahanga angaanga E9.5 i tino heke.(F) He rite te whakahekenga o nga taumata Pan-AKT i roto i nga lysates o nga pūtau SPECC1L-kd U2OS i hauhaketia i te huinga teitei.Ko nga pae hapa e tohu ana i nga SEM mai i nga inenga paraka motuhake e toru o te Tai Hauauru.(GJ) Ko nga waahanga o te WT embryos i E9.5 kua pania ki te KI67 me te caspase 3 kua wehea, e whakaatu ana i te tipu o te pūtau (G, G') me te iti o te mahi apoptotic (H, H').Ko te Specc11 mutant embryos e whakaatu ana i te whakaraeraetanga o nga pūtau (I), engari kua tino piki ake te maha o nga pūtau e mau ana i te apoptosis (J).
Na ka tirotirohia e matou nga tohu o te tipu me te apoptosis.Kaore matou i kite i tetahi rereketanga i roto i te tipu o te E9.5 embryos (Fig. 6E, G whakaritea ki a I) me te taurangi whakanui o te 82.5% mo nga mutants WT me te 86.5% mo nga mutants Specc1l i inehia e te KI67 staining (p <0.56, Fisher's whakamātautau tika).Waihoki, kaore matou i kite i tetahi rereketanga o te apoptosis i inehia ma te taatai ​​​​mo te caspase 3 kua pakaruhia i roto i nga kopa neural i te E8.5 tae noa ki te hopukina o te kukune (kaore i whakaatuhia) (kaore i whakaatuhia).Engari, i tino piki ake te apoptosis i roto i nga embryos mutant E9.5 katoa (Fig. 6F, H me J).Ko tenei pikinga katoa o te apoptosis e rite ana ki te whakaheke i te tohu PI3K-AKT me te mate o te embryonic wawe29,30,31.
I muri mai, hei whakapumau i tetahi mahi take mo te tohu tohu PI3K-AKT i nga huringa AJ i roto i o maatau pūtau kd, i whakarereketia e matou te huarahi i roto i te mana whakahaere me nga pūtau kd (Whakaahua 7A-F).I whakamahia e matou hei tohu te ahua o te huringa o te ahua o te pūtau i kitea i roto i te huinga o nga pūtau SPECC1L-kd, i inehia e matou ma te whakamahi i te ōwehenga o te inenga roa rawa (roa) ki te inenga poutū (whanui).Ko te ōwehenga o te 1 e tika ana mo nga pūtau porowhita, porowhita ranei (Whakaahua 7G).I tua atu i te ahua o te pūtau, i whakapumautia ano e matou te paanga ki runga i te AJ na te β-catenin staining (Fig. 7A'-F').Ko te whakakore i te huarahi PI3K-AKT ma te whakamahi i te wortmannin i ranea ki te whakarereke i te ahua o te pūtau i roto i nga pūtau whakahaere (Whakaahua 7A, C) me AJ (Whakaahua 7A').Ko te activator PI3K-AKT SC-79 kaore i pa ki te ahua o te pūtau (FIG. 7A, E) ranei AJ roha (FIG. 7A') i roto i nga pūtau mana.I roto i nga pūtau SPECC1L-kd, ko te whakakorenga atu o te ara PI3K-AKT i hua ake te apoptosis (Fig. 7B, D) me te piki ake o te β-catenin staining (Fig. 7B '), e rite ana ki o tatou in vivo heavy mutants.Ko te mea nui, ko te whakahoahoatanga o te ara PI3K-AKT i tino pai ake te ahua o te pūtau (Whakaahua 7B,F) me nga tohu tohu AJ (Whakaahua 7B").Ko nga huringa i roto i te ahua o te pūtau i inehia hei ōwehenga porowhita pūtau (CCR) ka whakatairitehia mo te hiranga pera i whakaahuahia i runga ake nei (FIG. 7G).Ae, i roto i nga ruma whakahaere (Fig. 7G, CCR = 1.56), he nui te maimoatanga wortmannin ki te whakarereke i te ahua o te pūtau (Fig. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) ki te ahua rite ki te mea i kitea. kei SPECC1L.-kd pūtau (Fig. 7G, CCR = 3.46).Ko te maimoatanga Wortmannin o nga pūtau SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3.60, iti) he mea nui atu i nga pūtau kd kaore i tukuna (Fig. 7G, CCR = 3.46, he iti) ranei nga pūtau mana whakahaere wortmannin (Fig 7G)., CCR = 3.46, karekau) ka pa atu ki te whakaroatanga o te pūtau (7G, CCR = 3.61, karekau).Ko te mea nui, ko te SC-79 AKT activator i whakahoki mai i te phenotype elongated o SPECC1L-kd pūtau (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Ko enei hua ka whakapumau ko te SPECC1L e whakahaere ana i te tohu tohu PI3K-AKT me te whakaaro ko te whakahekenga iti o te SPECC1L ka pa ki te piri o te pūtau, ko te heke kaha ka arahi ki te apoptosis (Fig. 8).
(A–F') Mana (A, C, E) me te SPECC1L-kd (B, D, F) nga pūtau i tukinotia ki te PI3K-AKT arai aukati wortmannin (C, D) ranei SC-79 activator (E, F) Maimoatanga .Ko nga pūtau mana whakahaere karekau i rongoa he kuboidal (A) me te β-cat staining pūtau (A'), ko nga pūtau kd he roa (B) me te piki ake o te β-cat staining (B').Whai muri i te whakakorenga o te ara PI3K-AKT, ka roa te roa o nga pūtau whakahaere (C) me te roha β-cat (C'), i te wa i timata nga pūtau kd ki te apoptosis (D), he rite ki o tatou kukune tino rerekee me te whakaatu i te β-cat tino pai ake.whakapouri (D').I muri i te whakahohenga o te ara PI3K-AKT, ka noho tonu nga pūtau whakahaere i te kuboidal (E) me te tae noa ki te β-cat (E'), i te wa i whakaatu nga pūtau kd i te pai ake o te ahua o te pūtau (F) me te β-cat (F'), e tohu ana. (G) Ko te tohu o te huringa ahua o te pūtau i roto i te (AF) i inehia ma te whakamahi i te ōwehenga porowhita pūtau (CCR) o te inenga roa rawa (roa) me te taha poutū (whanui) ma te whakamahi i te rorohiko MetaMorph.Ko nga pūtau SPECC1L-kd (CCR = 3.46) kaore i mahia (NT) he tino roa ake i nga pūtau whakahaere (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Ko te aukati a Wort i te ara PI3K-AKT i roto i nga pūtau whakahaere he rawaka ki te whakaroa i te ahua o te pūtau (CCR=3.61, p<2.4×10-9).Waihoki, ko te whakahohe AKT e SC-79 i roto i nga pūtau SPECC1L-kd i whakahokia te roanga pūtau ki te whakahaere i nga taumata (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Ko te maimoatanga Wortmannin o nga pūtau SPECC1L-kd i piki ake te apoptosis engari kaore he piki ake o te huringa ahua o te pūtau (CCR=3.60) i whakaritea ki te kd kaore i rongoatia (CCR=3.46, ns) ranei nga pūtau whakahaere wortmannin-treated (3.61) i kitea i .ns = karekau he aha.+/- Kua whakaatuhia nga inenga SEM mo te 50 nga pūtau.I tatauhia nga rereketanga tatauranga ma te whakamahi i te whakamatautau-t a te tauira.
(A) Whakaaturanga hoahoa mo te aukati me te whakahohe i te ara PI3K-AKT ka puta nga huringa AJ me te whakaoranga, ia.(B) He tauira e whakaarohia ana mo te whakapumautanga pūmua AKT na SPECC1L.
Ko nga CNCC Tuhinga o mua e hiahia ana te AJ lysis ki te wehe mai i nga ruma neuroepithelial neural fold o mua1,15,32.Te piki ake o te whakapouri o nga wahanga AJ me te ngaro o te tohatoha AJ asymmetric apical-basal i roto i nga pūtau ngoikore SPECC1L i roto i te vitro me te in vivo, me te tata a tinana o SPECC1L ki te β-catenin, e tohu ana ka mahi a SPECC1L ki te pupuri tika i te AJ o te rohe mo nga uaua whakahaere.cytoskeleton actin.Ko te hononga o SPECC1L me te cytoskeleton actin me te β-catenin me te piki ake o te maha o nga filaments actin condensed i te kore o SPECC1L e rite ana ki te piki haere o te AJ kiato.Ko tetahi atu pea ko te pikinga o nga muka actin i roto i nga pūtau kore-SPECC1L ka arahi ki te huringa i roto i te awangawanga o waenga pūtau.Na te mea ka pa te ahotea pūtau ki te AJ 33 hihiri, ka puta nga huringa ngaohiko ka nui ake te AJ 34.Na ko nga huringa ka pa ki nga paparanga CNCC.
Ko te Wnt1 ka whakaatuhia i roto i nga kopa neural tomua ka puta mai nga pūtau hiwi neural.No reira, ka tohuhia te whakapapa whakapapa Wnt1-cre i mua me te heke o NCC35.Heoi ano, ka tohu ano a Wnt1 i nga karaehe kiko o te roro tuara i ahu mai ano i nga kopa neural wawe 35,36, na te mea ko ta tatou whakapouri o nga mutants E9.5 mo nga tohu Wnt1 i roto i nga kopa neural tuwhera ehara i te CNCC.Ko ta matou whakakikoruatanga pai mo nga tohu NCC AP2A me SOX10 i whakapumau ko nga kopa neural o Specc11 mutant embryos kei roto tonu te CNCC.I tua atu, i te mea ko te AP2A me te SOX10 nga tohu mo te heke wawe o te NCC, i tohuhia e te whakapouri pai ko enei pūtau he CNCC i muri i te hekenga e kore e taea te whakararangi e E9.5.
Ko o maatau korero e kii ana ko te ture iraro o AJ na SPECC1L ka takawaenga e te tohu PI3K-AKT.Ka whakahekehia te tohu tohu AKT i roto i nga pūtau me nga kopa ngoikore o te SPECC1L.Nga kitenga na Fantauzzo et al.tautoko i tetahi mahi tika mo te tohu PI3K-AKT i roto i te morphogenesis craniofacial.(2014) i whakaatu ko te kore o te whakahoahoatanga o te tohu tohu PI3K-AKT e ahu mai ana i te PDGFRα e arahi ana ki te ahua o te papa.Ka whakaatu hoki matou ko te aukati i te ara PI3K-AKT he rawaka ki te huri i te AJ me te hanga pūtau i roto i nga pūtau U2OS.E rite ana ki o maatau kitenga, Kaina et al.37 i whakaatu ko te whakahekenga o te PI3K α110 subunit i roto i nga pūtau endothelial e hua ana i te ahua o te pikinga o te β-catenin staining pericellular, e kiia ana ko te piki ake o te "taurangi hononga".Heoi, i roto i nga pūtau endothelial kua tino whakaritehia nga kakawaea actin, ko te pehitanga o te ara PI3K-AKT ka hua te ahua o te pūtau wetekina.He rereke, i whakaatu nga pūtau SPECC1L-kd U2OS i te hanga pūtau roa.He momo pūtau motuhake pea tenei rereketanga.Ahakoa te pehitanga o te tohu tohu PI3K-AKT ka pa ki te cytoskeleton actin, ka whakatauhia te paanga ki te ahua o te pūtau na nga huringa o te awangawanga na nga huringa o te kiato me te whakaritenga o nga muka actin pokapū.I roto i nga pūtau U2OS, i whakamahia noa e matou nga huringa ahua o te pūtau hei tohu mo te huringa me te whakaora i te AJ hapa SPECC1L.Hei mutunga, ka whakapae matou ko te aukati i te ara AKT i roto i te ngoikoretanga o SPECC1L ka piki ake te pumau o te AJ me te whakaiti i te delamination i roto i te CNCC.
Ko te mea whakamiharo, i whakahekehia nga taumata pan-AKT i roto i te vitro me te vivo i tua atu i nga taumata phosphorylated 473-AKT i te kore o SPECC1L, e kii ana he ture mo te tohu PI3K-AKT i te taumata o te pumau o te pūmua AKT, te hurihanga ranei.Ko nga ira SPECC1L me MID1, e hono tahi ana ki te mate Opitz/GBBB, ka whakawaehere i nga pūmua e whakapumau ana i nga microtubules 18,22 .Kaore i te tino marama te tikanga e mahia ana e SPECC1L me MID1 te whakapumautanga microtubule.I roto i te take o SPECC1L, kei roto i tenei whakapumautanga te whakakaha ake o te acetylation o tetahi wahanga o nga microtubules 18 .Ka taea e te SPECC1L te whakamahi i tetahi tikanga rite ki te whakapumau i etahi atu pūmua penei i te AKT.Kua whakaatuhia ko te acetylation o nga toenga lysine i roto i te pūmua AKT ka arahi ki te heke o te waahi o te membrane me te phosphorylation38.I tua atu, ko te ubiquitination o te mekameka K63 i te toenga lysine ano i runga i te AKT e hiahiatia ana mo tona waahi membrane me te whakahohe39,40.I roto i te maha o nga mea e pa ana ki nga pūmua SPECC1L kua tautuhia i roto i nga momo mata rewharewha teitei e rua-hybrid, e wha - CCDC841, ECM2942, APC me UBE2I43 - kua uru ki roto i te huringa pūmua, te pumau ranei na roto i te ubiquitination, te sumoylation ranei.Ka whai waahi pea a SPECC1L ki te whakarereke i muri i te whakamaoritanga o nga toenga lysine AKT, e pa ana ki te pumau o te AKT.Engari, ko te mahi nui a SPECC1L i roto i te waahi me te pumau o te pūmua AKT kei te noho tonu ki te whakamarama.
Ko nga hapa nui i roto i te whakaaturanga SPECC1L i roto i te vivo i piki ake te tohu tohu AJ me te whakakikorua o te CNCC hapa, me te piki ake o te apoptosis me te mate o te embryonic wawe.Ko nga purongo o mua kua whakaatuhia ko nga mutants kiore me te piki ake o nga taumata o te apoptosis e hono ana ki nga ngoikoretanga ngongo neural 44,45,46,47 me nga ngoikoretanga craniofacial48.E kiia ana ko te mate nui o nga pūtau i roto i nga kopa neural, i nga whao pharyngeal ranei ka puta he iti rawa te maha o nga pūtau e hiahiatia ana mo te nekehanga morphogenetic tika 48,49,50.He rereke, ko o maatau raina pūtau ngoikore SPECC1L me te whakaaturanga SPECC1L he iti te whakaheke i whakaatu i nga huringa AJ anake kaore he taunakitanga o te pikinga o te mate o te pūtau.Heoi, ko te aukati matū o te ara PI3K-AKT i roto i enei pūtau Kd i piki ake te apoptosis.No reira, ko te whakahekenga o te korero SPECC1L me te mahi ranei ka mau te ora o te pūtau.He rite tonu tenei ki te kitenga ko nga pepeke mutant Specc11 onge ka mawhiti i te hopukina i te st.E9.5—no te iti o te kaha o te hopu ira ira—ka taea te kati i o raatau ngongo neural ka mutu i muri mai i te whanaketanga, he maha nga hapa o te craniofacial (Fig. S3).E rite ana ano ki tenei ko te ahua onge o nga embryos Specc1l heterozygous me nga momo kino o te craniofacial — na te kaha ake o te hopu ira ira—me te kitenga o te ika zebrafish e puta ai tetahi o nga orthologues SPECC1L e rua (specc1lb) i nga ahuatanga o te kukune mutunga, tae atu ki te ngaro kauae o raro me nga kapiti taha51.No reira, ko nga huringa mate-o-mahi heterozygous SPECC1L kua tautuhia i roto i nga turoro tangata ka raru pea te ngoikoretanga o te mahi SPECC1L i te wa o te morphogenesis craniofacial, e ranea ana ki te whakamarama i o raatau kohanga orofacial.Ka whai waahi ano te whakaritenga SPECC1L mo nga hoapaki intercellular ki te palatogenesis me te whakakotahitanga o nga kikorangi pharyngeal.Ko etahi atu rangahau mo te mahi SPECC1L ka awhina i te whakamaarama i te waahi o nga hoapaki intercellular rangitahi i roto i te CNCC i te wa e kati ana te ngongo neural i roto i te motiness cell neuroepithelial me te morphogenesis craniofacial.
Ko te mana o te osteosarcoma U2OS me nga pūtau SPECC1L-kd kua whakaahuahia i mua (Saadi et al., 2011).Ko nga antibodies ki te SPECC1L kua whakaatuhia ano i mua (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin antibodies (rabbit; 1: 1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (kiore; 1: 1000; Hangarau Waitohu Pūtau, Danvers, MA), myosin IIb (1: 1000; Sigma-Aldrich, St. ), MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Hangarau Waitohu Pūtau, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Hangarau Waitohu Pūtau, Danvers, MA), kua pakaruhia te caspase 3 (1:1000; Hangarau Waitohu Pūtau, Danvers, MA) me te β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) i whakamahia kia rite ki te korero..I pania nga kakawaea Actin ki te Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Ko nga pūtau whakahaere U2OS me nga pūtau SPECC1L-kd i whakatipuhia i roto i te DMEM huka teitei paerewa me te 10% te serum bovine fetal (Life Technologies, Carlsbad, CA).Mo nga huringa AJ, 2 x 105 nga pūtau i ruia ki runga i te karaehe i rongoa ki te 0.1% porcine gelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ka tirohia mo nga huringa o te ahua o te pūtau.I kohia nga pūtau ki nga waahi rereke kua tohua: 4 haora i muri i te rui (t = 1), 24 haora i muri i te rui (t = 2), te whakakotahi me te kore rereke o te ahua o te pūtau (t = 3), te rereke o te ahua o te pūtau (t = 4) , 24 haora i muri i te huringa ahua pūtau (t = 5) me te 48 haora i muri i te huringa ahua pūtau (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Hei whakarereke i te huarahi PI3K-AKT, i whakatipuhia nga pūtau ki nga kohinga kua tohua me te PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ranei SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Ko te reo e mau ana i nga matū i hurihia ia ra.
I mahia nga rekoata anga-a-anga i runga i te mana ora me nga pūtau KD i raro i nga tikanga ahurea noa, ka kohia nga whakaahua rereke i ia 10 meneti mo te 7 ra.I whiwhihia nga whakaahua ma te whakamahi i te miihini whakahurihia a Leica DM IRB i te rorohiko me te waahi miihini me te kaupapa 10 × N-PLAN e hono ana ki te kamera QImaging Retiga-SRV.I te wa o te whakaahua, ka mau tonu nga ahurea pūtau ki te 37 ° C i roto i te hau makuku me te 5% CO2.
E rua nga mahanga ira ira ES raina pūtau DTM096 me RRH048 mai i te Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) i whakamahia hei whakaputa i nga raina kiore hapa Specc11, kua tohua ko Specc1lgtDTM096 me Specc1lgtRRH046.I te wa poto, 129 / REJ ES nga pūtau i werohia ki roto i te C57BL6 blastocysts.Ko nga kiore tane chimeric i whakatipuhia me nga kiore wahine C57BL6 hei tautuhi i nga uri kua tae ki te koti agouti.Ko te waahi o nga whakaurunga vector mahanga ira i whakamahia hei tautuhi i nga heterozygotes.I pupurihia nga kiore i runga i te papamuri hanumi o 129/REJ;C57BL6.Ko te waahi o te waahi whakauru o te mahanga mahanga ira i whakapumautia e te RT-PCR, te raupapa ira, me te taapiri ira (Whakaahua 1).Hei whai i te whakapapa CNCC o nga kiore Specc1lGT heterozygous takirua, ROSAmTmG (#007576) me Wnt1-Cre (#003829) kiore (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) i whakawhiti ki te whakaputa i te ROSAmTmG me Wnt1-Cre allele i Specc1osl mute.Ko nga whakamatautau katoa i roto i nga kiore i mahia i runga i nga kawa kua whakaaetia e te Komiti Tiaki Kararehe mo te Whare Wananga o Kansas Medical Center.
I whakaritea nga kukune ki roto (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) mo te 60 meneti i te pāmahana rūma.I muri i te whakatikanga i roto i te wairewa whakakikorua X-gal (5 mM pāhare pāporo ferricyanide, 5 mM pāhare pāporo ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% konutai deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) I mahia te whanaketanga stain i te 37°C .°C i roto i nga haora 1-6.Ko nga kukune i muri i te whakatika i roto i te 4% PFA ka kitea.
Mo te whakakore i te Tai Hauauru, ka whakahekehia nga pūtau i roto i te kaitautoko lysis hāngū (Promega, Fitchburg, WI) kua taapirihia ki te ranunga o nga aukati protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).I tukatukahia nga Lysates i runga i te 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX kua oti te hanga (Bio-Rad, Hercules, CA) me te whakawhiti ki te Immobilon PVDF membranes (EMD Millipore, Billerica, MA).I aukatihia nga kiriuhi i roto i te 5% miraka i roto i te PBS kei roto 0.1% Tween.I whakakororiahia nga antibody i te po i te 4°C mo te kotahi haora ranei i te pāmahana rūma.Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) i whakamahia mo te whakaputa tohu.Mo te immunostaining, ka whakatauhia nga embryos mo te po i roto i te 4% PFA/PBS me te cryopreserved.I aukatihia nga tangihanga o te kopa i roto i te PBS kei roto ko te 1% serum koati noa (Thermo Scientific, Waltham, MA) me te 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ka whakakororia i te 4°C i roto i te incubator po.me te anti-antibody me te karewharewha tuarua antibody (1:1000) mo te 1 haora i te 4°C.I whakauruhia nga waahanga kua poke ki roto i te reo koura ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) me nga whakaahua papatahi i whiwhi ma te whakamahi i te karuiti confocal Leica TCS SPE.I mahia ia immunostaining hei whakamatautau motuhake e toru i runga i nga cirossections o te iti rawa e rua nga embryos mutant.Ka whakaatuhia he whakamatautau tohu.
I incubated nga pūtau i roto i te RIPA buffer whakarereke (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, me te HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) I te wa poto, i purea nga lysates ki nga pirepire autō G (Life Technologies, Carlsbad, CA) katahi ka whakakororia i te po i te 4° C. me te anti-SPECC1L me te IgG pūmua G i whakamahia nga pirepire pūmua G hei tango i te SPECC1L me te whakakore i te Hauauru ma te whakamahi i te anti. -β-catenin antibody i whakaahuatia i runga ake Ko nga whakamatautau co-IP kua whakaatuhia he tohu mo nga whakamatautau motuhake e wha.
I whakawhiwhia nga pūtau whakatipu kiore, kopa embryonic kiore ranei ki te pokapu miihini hiko i te Whare Hauora o te Whare Wananga o Kansas.I te wa poto, i whakauruhia nga tauira ki roto i te EMbed 812 resin (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), ka polymerized i te po i te 60°C, ka wehea ki te 80 nm ma te whakamahi i te Leica UC7 ultramicrotome kua mau ki te mata taimana.I whakaatahia nga waahanga ma te whakamahi i te miihini hiko hiko JEOL JEM-1400 i mau ki te pu 100 kV Lab6.
Me pehea te tuhi i tenei tuhinga: Wilson, NR et al.Ko te ngoikore o te SPECC1L ka piki ake te pumau o nga hononga hono me te whakaheke i te whakaheke o nga pūtau neural crest cranial.te pūtaiao.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Te whakaurunga me te rerekeetanga o te hiwi neural.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Ko nga pūtau neural cranial e neke ana: to ratou mahi i roto i te whanaketanga craniofacial.American Journal of Medical Genetics.Wāhanga A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: tona tipu me te whanaketanga i runga i te 20 tau.Taonga tamaiti.pathology.taiwhanga.rongoa.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU me Noten MM Breakthrough i roto i nga ira o nga kohanga orofacial.Te Ia i roto i te rongoa Molecular 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. me Riley, FM Nga tikanga rapoi o te hekenga o te puopu neural neural crest me te tauira i te wa o te whanaketanga craniofacial.Whanaketanga 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH me Murray, JK Te ngutu ngutu me te ngutu: te mohio ki nga awe o te ira me te taiao.korero maori.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Ko te morphogenesis rereke o te kiri, nga peka, me te rohe craniofacial i roto i te interferon-regulating factor-6 (Irf6) -kiore kore.National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Ko nga huringa nui i roto i te GRHL3 ka pa te mate o te van der Waord me te whakararu i te whanaketanga o te periderm waha.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ me Juriloff, DM Whakahouhia te rarangi o nga mutant kiore me nga hapa o te katinga ngongo neural me te ahu whakamua ki te tino maaramatanga ira mo te katinga ngongo neural.Te tirotiro i nga koha whanau.Wāhanga A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. Ko te tohu PDGFRalpha te takawaenga a P. PI3K e whakahaere ana i te oranga me te whakatipu i roto i te whanaketanga koiwi na roto i te huarahi intracellular e whakawhirinaki ana ki te p53.Whanaketanga Ira 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND and Murdoch, JN Disheveled: Te hononga o te toronga whakawhiti ki te katinga ngongo neural.Nga ahua o te neurology.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).